マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

注：このプロトコルは、96ウェルプレート、8チューブストリップ、およびキャピラリーベースのシステム（10μlの反応容量）のためのボリュームと濃度を含み、しかしながら、HRMはまた、それに応じてすべてのボリュームをスケーリングすることにより5μlの反応体積で384ウェルプレートベースのシステムで実行することができます。ほとんどのシステムの検出範囲は、10 ngの鋳型DNAには10pgです。 1.テンプレートを準備します現場調査に参加した患者から得られた全血として格納され、赤血球をペレット化し、またはろ紙上の血液から直接、熱帯熱マラリア原虫のサンプルを得ます。 注：サンプルはまた 、インビトロで成長する培養に適合させることができます。分析のためのいくつかの標準的な実験室株は、マラリア研究およびリファレンス試薬リソースセンター（MR4から注文することができ、サンプルをペレット化し、赤血球または培養物から直接使用するか、または全血、赤血球、またはろ紙から抽出することができます。 から抽出したDNAろ紙または培養適合株注意：HRMは、塩濃度に敏感です。可変抽出方法による濃度差が大きく溶融温度に影響を与えることができます。特定の最終バッファは成功のための重要な要因ではありませんが、標準的な一般的な溶出または再懸濁バッファー（ すなわち 、水、1×TE ['低テ」または「DNA懸濁液バッファー」：10mMのトリス-Cl、0.10 mMのEDTA]を使用しますか、 1×TE [10mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA]）全てのサンプルが異常なまたは矛盾融解曲線を回避するため。 各10μlの反応のための標準的なテ、TE、または水に10 pgの-10 NGあたりμLのテンプレート希釈液を調製します。 ペレット化した赤血球からの直接増幅薄塗抹顕微鏡を用いて赤血球の寄生虫血症を決定注：感染した赤血球の寄生虫を決定するための方法は、疾病管理予防センター（CDC）から入手可能であります。http： //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html PCRグレードの水、TEで400、またはTE：0.5％1上記の寄生虫血症を希釈します。それぞれ5〜10μlの反応のために3μLを使用してください。 コントロール注：HRM配列が集団12に変異体を検出するための遺伝子走査のために使用することができます。しかし、正確なジェノタイピングは標準シーケンス検証済みSNPを含むことが尋問されている必要があります。既知の遺伝子型を使用することができるとともに、プラスミド構築物またはマラリアは隔離します。ほとんどのアプリケーションでは、3D7（MR4 MRA-151）は、野生型対照として使用します。原因間のランの変動に、常に正と負のコントロールが含まれています。 陽性対照は： – 配列検証済みSNP遺伝子型と1μlのプラスミドの希釈液または標準あたり10 ngの10頁を準備します。 増幅反応のための無鋳型対照（NTC）として使用するPCRグレードの水：ネガティブコントロール。 ve_title "> 2。PCR増幅反応混合物を準備します （オプション）ミネラルオイルオーバーレイ。注：一部のHRMシステムは、スタンドアロンの溶融・プラットフォームであり、増幅の間に結露や製品の蒸発を防ぐために加熱蓋を持っていません。 反応混合物をロードする前に、各ウェルプレートに20μlの軽鉱物油を追加します。 すべてのアッセイの10倍ワーキングストックを準備します推奨10倍作業ストック濃度と同様にブロックされたプローブベースのHRMジェノタイピングのための最終的な濃度は、表1を参照してください。 反応混合物を準備しますプレートまたはチューブ内の各ウェルに、前方に1μlの10倍の作業ストックを追加して、プライマーおよびプローブ、4.0リバース – 10μlの総反応容量のために5.0μlの2.5倍または2.0倍のHRMマスターミックス、1μlのテンプレート、およびPCRグレードの水を。 カバープレートまたはチューブ光学板Sを使用しますキャピラリーベースのシステム用のプレートベースの増幅のためのEAL、ストリップチューブ・ベース・システム用の光学キャップ、プラスチックキャップ。カバレッジが完了し、プレートやキャップが完全に密封し、増幅中の蒸発を防ぐために固定されていることを確認してください。 スピンサンプルスピンプレート1800×gで3分間、気泡を除去し、鉱油が使用される場合、油相と水相とを分離します。 増幅プロトコールサーマルサイクラーで反応プレートまたはチューブを置きます。ファイル名を指定して実行標準ブロックされたプローブまたはMAAB増幅プロトコール（それぞれ表2、表3）。これらの方法の間のアニール温度の違いに注意してください。 3. HRM解析融液 PCR増幅した後、分析を溶融に進みます。内蔵されていません増幅スタンドアロン溶融システム（ 例えば 、BioFire防衛LightScannerシステム）については、再HRM機器におけるサーマルサイクラーと場所から増幅プレートを移動します。プローブとアンプリコンの両方の融解ピークを生成するために80°C – システムソフトウェアインターフェースから、40からプレートを溶かします。 注：溶融および分析時間を節約するために、溶融ウィンドウは単にプローブ又は単位複製配列融解領域のための温度範囲をカバーするように短くすることができます。必要に応じて溶融した後、プレートおよびチューブは再溶融することができ、-20℃または4℃で保存しました。クラッキングからチューブを防ぐ唯一の4℃での保存のガラス管。 メルト分析陰性サンプルを削除解析ソフトの中では、増幅またはそれはギザギザの融解ピークを持っていなかったさらなる分析試料から取り除きます。注：個々の実行ファイルの解析のモードを選択した後、機器は自動的にグループ正と負のサンプルを。各サブセットの遺伝子型を決定する前に、ユーザーが手動で呼び出しを変更することができます。 融点のいずれかから曲線または融解ピークビュー、曲線を右クリックし、それらを選択するために除去されます。誤分類されたサンプルを選択した後、適切なグループを選択し、クリックして "、新しいコール」に進んで「変更を適用します。」 ノーマライズ温度（-dF​​ / DT）（ '差異曲線'）ビューに関して正規化蛍光の負の微分から、プローブの溶融領域を囲む正規バーを移動します。 注：プローブは、領域が2溶融領域のより低い温度で溶融します。正規のバーは、溶融ピークのベースにする必要があります。 グループを計算します正規化した後、自動的にグループにサンプルを割り当てるために「計算グループ」を選択します。 特定のグループに必要な場合は、手動で再割り当てサンプル。 注：一部の解析ソフトウェアを変更することはできません高感度のしきい値があります。これらの場合において、複数のoftwareは、視覚的に別のものに属す​​る別のグループにサンプルを割り当てることができます。 遺伝子型の割り当て標準（陽性対照）に基づいて、グループごとに遺伝子型を割り当てます。 （、正しい変化が誤分類サンプルを選択し、「新しいコール」の横にあるドロップボックスから右のグループを選択してグループ化]タブの下で行われていない場合）、ユーザは計算されたグループが正しいことを確認した後、「編集グループ名を選択グループ "タブ"の下に "。 対応する色付きのボックスに標準の遺伝子型を入力します（標準3D7は、既知の遺伝子型を持っており、赤のグループにある場合、例えば、赤のグループは、遺伝子型Aを有し）。 "OK"を押して、結果を保存します。 結果のエクスポート輸出遺伝子型は、さらにサンプル集団の分析のためのスプレッドシートとして呼び出します。