췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

인간의 PDAC 종양은 서면 동의서 (욱 마드리드, 스페인 (CP CNIO-CTC-11를 얻었다 -. CI 103분의 11-E) 면역 결핍 쥐에 인간의 췌장 종양의 주입은 임상 시험 심사위원회의 승인을 필요로뿐만 아니라 기관 . 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 이종 이식 췌장 종양 마우스 모델의 절차는 기관 및 국가 규정에 따라 실시해야 (, 마드리드, 스페인, 여기 윤리 연구소의 드 건배 카를로스 III위원회 프로토콜 PA 34_2012)를. 1. 문화 미디어 완전 배지를 준비합니다. 10 % FBS, 100 단위 / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 RPMI 배지를 보충합니다. RPMI 500 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 U / ㎖, 100X)의 열 불 활성화 FBS 55 ml의 6 ml를 추가하세요. 4 ℃에서 완전 배지를 저장합니다. 암줄 기세포 중간을 준비합니다. 무 혈청 DMEM / F12의 mediu 보충100 단위 / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM의 글루타민과 M. 4 ° C에서 CSC 매체를 저장합니다. B27 (1시 50분) 20 NG / ㎖의 bFGF 갓 각 실험 전에 배지에 첨가된다. 주 : B27의 첨가가 구 종양 형성을 증가시키고 배양 구 (32)의 여러 통로를 유지하는 것으로 나타났다. 배지 조성물은 중요한 단계 인 배양과 각 세포 유형에 대해 시험 할 수있다. 우리는 테스트 자기 갱신과 구체의 분화 능력을 권장하고 유동 세포 계측법에 의해 CSC 마커의 발현을 분석 (즉, CD133 +와 CD44 +). 세포 외 유출 분석 중간을 준비합니다. 이 특정 매체는 비타민, 아미노산 및 기타 보충제를 포함하지만, 글루타민, 포도당, 피루브산과 중탄산염이 부족한 기초 DMEM 5030입니다. 현재의 분석을 위해, 전체 미토콘드리아 대사 활동에 2 mM의 글루타민, 8 mM의 글루코오스, 2 mM의 피루브산 나트륨을 가진 매체를 보충. 주 : 배지 정규 함유 중탄산 분석시의 pH 변동을 완충하기 때문에, 중탄산 나트륨의 부재 정확하게 배양에서 성장하는 세포의 세포 외 산성화를 측정하기 위해 필수적이다. 또한, 기초 배지의 사용은 (L 알라 닐 글루타민)을 L – 글루타민 포도당 또는 다른 분석 조건 및 / 또는 애플리케이션에 필요한 피루브산 나트륨 농도의 엄격한 제어를 허용한다. 2. 구 분석 실험 및 분석을 형성 참고 : 모든 조직 배양 프로토콜과 조작 청소, 세제 무료, 멸균 유리를 사용하여 큰 관심과 멸균 기술을 사용하여 수행해야합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 사용, 미리 따뜻한 모든 매체 및 솔루션 전 (대안으로, 당신은 매체 및 솔루션을 RT에서 미리 예열을 사용할 수 있습니다). 이전 21 설명 된대로 인간의 PDAC 종양을 얻습니다. 인간의 PDAC에서 암줄 기세포의 분리 (그림1) 멸균 바이오 캐비닛 1X 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 함유하는 60 X 15mm 배양 접시 PDAC 인간 조직을 옮긴다. 멸균 메스와 집게를 사용하여 – (5 MM 1) 작은 조각으로 종양을 말하다. 배양 접시에 무균 1X 1 ㎖의 PBS를 추가하고 조직이 완전히 분해 될 때까지 분쇄 단계를 반복, 정기적으로 3 ~ 4 라운드를 필요로한다. 멸균 된 튜브에 (위쪽 1X PBS와 함께 5 ㎖의 최종 부피까지) 조직 현탁액을 전송과 같은 기계적으로 gentleMACS dissociator 함께 균질화. 콜라게나 균질 조직을 37 ° C에서 60 분간 (2.5 밀리그램 / 1X PBS에서 콜라게나 제의 용액을 사용)하고 900 x g에서 5 분간 원심 분리하여 부화. 뜨는을 가만히 따르다 및 완전 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 900 × g으로 5 분 동안 40 ㎛의 여과기 및 원심 분리기를 통해 세포 현탁액을 필터. 뜨는을 가만히 따르다과를 재현 탁적혈구 용해 완충액 5 ㎖ (암모늄, 염화 칼륨, ACK)로 펠렛을 배양하고 젤라틴 코팅 접시에 암줄 기세포 매체, 판에 펠렛을 재현 탁하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. 이 단계는 신속하게 판에 부착 섬유 아세포의 대부분을 제거합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 조심스럽게 제거하고 세포 현탁액을 회수하고 혈구를 이용하여 실행 가능한 (트립 판 블루 음성) 세포 수를 정량화. 이를 위해, 현탁액을 부드럽게 혼합하고 에펜 도르프 튜브로 현탁액 20 μL 피펫. microcentrifuge 관의 세포에 트리 판 블루 (1 비율 1)과 잘 혼합 20 μl를 추가합니다. 피펫 혈구 상 혼합물을 약 10 μL. 생균 수의 계산 챔버의 네 모서리 사분면 내의 모든 명확한 세포를 계산합니다. 참고 : 세포의 생존과 수율이 종양 표본 사이에 상당히 다를 수 있습니다. PDAC 들어 샘플 생존 정기적 betwe 범위45-70% 도중, 및 (3)의 직경을 갖는 거시적 종양 샘플에서 조직편 – 5 ㎜는 대략 6 × 105 생세포로 수득한다. 구 형성 분석 및 메트포민 치료 세포의 필요한 수를 취하여 2,000 세포 / ml의 세포 농도를 제조 된 CSC 매체의 적절한 볼륨. 1 시간 이상 더 이상 얼음에 세포 현탁액을 유지하고 도금 아니라 이전에 혼합하지 마십시오. 매체 증발을 최소화하기 위해 가습 24 웰 플레이트의 처음과 마지막 행에 1X PBS의 500 μl를 추가합니다. 종양 구 배지 1 ㎖ (2,000 세포 / ml)에 웰 당 2000 세포의 밀도에서 매우 낮은 세포 부착 플레이트로 세포를 시드. 참고 : 종양의 종류에 따라서 다릅니다 종양 구 형성 분석에 사용되는 세포의 수입니다. 차량 (대조군)과 각각의 할당 처리와 4 우물, 메트포르민의 예. 3 mm의 최소 4 우물을 취급합니다. 경기 수37 ° C로 설정 배양기에서 세포를 에이스 일주일 동안 5 % CO 2 세포를 공급한다. 주 : 배지 종양 분야의 교란 형성을 허용하기 위해 변경되지 않아야하지만, 그들은 배지에서 안정적이지 같이 매일 성장 인자 얹어 수있다. 다른 모든 일 처리, 각 웰에 메트포르민 또는 차량의 예., 3 mM의를 추가합니다. 큰 구조 (도 2)의 계산을 가능하게하는 자동 세포 계수기를 사용하여도 5 및 / 또는 제 7 일 후 형성된 종양 분야의 수를 평가한다. 주 : 각각 – – (120 μm의 80)는 적어도 40 ㎛의 만 종양 분야는 고려되어야 작은로 분류 될 수있다 (40 내지 80 μm의) 또는 대형. 결과는 (예를 들면, 셀 2000)의 시드 세포의 초기로 나눈 종양 분야의 비율로서 설명 될 수있다. 1 세대 종양 분야의 직렬과 Passaging <ol> 7 일간 배양 한 후, 40 ㎛의 세포 여과기를 이용하여 종양 분야 수확하고 RT에서 900 XG에서 5 분 동안 원심 분리하여 그들. 트립신을 사용하여 단일 세포 종양 분야의 펠렛을 해리 한 후 전술 한 바와 같이 다른 칠일 (2.2 참조)를 다시 수득 단세포 세포 현탁액을 확장. 3. 대사 분석 (ROS 생산 및 산소 소비) ROS 생산 이 활성 산소 검출, 저렴한 빠르고 널리 사용되는 프로브 때문에이 프로토콜에서는, 우리는 활성 산소의 생산을 측정하기 위해 예를 들어 카르복시 – DCFDA 사용했다. 그러나,이 분석에 사용할 수있는 여러 가지 다른 프로브 및 방법이있다. 시간의 할당 된 금액에 대해 2.2에 기술 된 바와 같이 메트포르민과 종양 분야를 취급합니다. 처리의 끝에서 40 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 수확 종양 분야는 5 분 동안 900 XG에서 세포를 원심 분리 tryps 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁인치 37 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션. 세포가 단일화되면 900 XG 원심 분리기 및 2.5 μM DCFDA 카르복시 함유 HBSS에서 세포를 재현 탁. 어둠 속에서 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션. 카르복시 – DCFDA이 사진 산화 거짓 긍정적 인 결과를 제공 할 수있는 분석 유동 세포 계측법에 앞서 빛에서 염색 된 세포를 보호합니다. 분석까지 얼음에 튜브를 놓습니다. 참고 : (.. 전 488nm, 520nm 사이 EM) 활성 산소와 질소 종의 다양한으로 반응 FL1에서 검출 된 후 카르복시 – DCFDA 형광입니다. 산소 소비량 측정 이 프로토콜을 위해, 우리는 예를 들어, 해마 생명 과학에서 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용합니다. 코트 RT에서 20 분 동안 세포와 조직 접착제 22.4 μg의 / ㎖의 용액을 사용하여 원하는 세포 배양 접시. 세포를 파종하기 전에 3 번 – 물 2 우물을 씻어. 처리의 마지막에, 수확 종양 구체 4를 사용0 μm의 셀 스트레이너, 원심 분리기에서 5 분 동안 900 XG에 세포 트립신 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 20 분 동안 품어. (150 μL의 최종 부피) 접시 / 웰로 96- 웰 플레이트에 30,000 세포의 밀도로 세포 배양 접시에 세포를 개편. 8 mM의 글루코오스, 2 mM의 피루브산 나트륨을 함유하는 산소 소비 분석법 배지에서 세포를 재현 탁. 100 XG에 도달 할 때까지 우물의 스핀 원심 분리하여 잘의 바닥에 세포를 원심 분리기 다음 브레이크 오프와 원심 분리기 정지를 할 수 있습니다. 접시의 방향을 반전하여 프로세스를 반복한다. 30 분 동안 이산화탄소의 첨가없이 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다. 한편, 분석 용 카트리지를 준비. 각각의 잘로드 할 4 가지 인젝터 (25 μL / 포트)이 있습니다 포트 : 메트포르민. 도 3 ㎜의 최종 농도를 얻기 위해 175 것 같은 최종 부피 8X 용액 (24 mm)를 준비μL 포트 A. 주입 후 포트 B : 메트포르민. 3 mm의 추가도 6 mM의 최종 농도를 얻기 위해, 포트 (B)의 주입 후 200 μL 것 같은 최종 부피 9x의 용액 (27 mm)를 준비 포트 C : 메트포르민. 3 mm의 추가도 9 ㎜의 최종 농도를 얻기 위해, 포트 C. 주입 후 225 μL 것 같은 최종 부피 10 배 용액 (30 mm)를 준비 포트 D : 로테 11 μm의는, 잘 (11 배)에 최종 농도 1μM을 얻었다. 주 : 로테 완전히 잔류 미토콘드리아 활성을 억제한다. 카트리지를 보정하고 세포 배양 플레이트를로드. 혼합 및 측정의 표준 프로토콜 분석을 수행합니다. (100 %로 설정)로 수득 로테 억제 백분율로서 메트포르민 의해 달성 총 미토콘드리아 호흡의 억제 백분율을 계산한다. 4.Immunocompromised에 마우스에서 인간의 췌장암에 대한 이종 이식 모델 참고 : 주문 실험 33 등 NOD-SCID, SCID-베이지, 또는 핵 공급국 그룹 (NSG)과 같은 여성 무 흉선 누드 또는 다른, 더 면역 마우스 모델의 충분한 수. 실험에 앞서 모든 수술 도구를 압력솥하고 사용하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 피하 종양을 위해 우리는 8 종양 총 측면 당 하나의 종양 상태 당 4 마우스의 최소값을 사용 하였다. 이종 이식 이식 인간의 췌장 암 조직 표본에서 종양 조각을 준비한다. 페트리 접시로 옮긴 후 ​​종양 조직을 보유하는 메스와 핀셋을 이용하여 (3 ~ 8mm, 직경 2 mm)를 작은 조각으로 조직을 해부. 젤라틴 단백질 혼합액으로 얻어진 조각을 딥 얼음에 보관. 3 % 이소 플루오 란 등 inhalative 또는 주 사용 마취제 – 1을 사용하여 마우스를 마취. 참고 : 어떤 수술 PROC를 시작하기 전에edure, 마우스가 완전히 복부 피부를 자극하여 의식을 분실 또는 가시 집게 한 쌍의 견인했는지 확인하십시오. 건조 함을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 마취 사항이 적용되면, 방부제 에탄올 함유 피부와 마우스의 뒷면을 닦아주십시오. 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏ BW) 이전에 수술 후 통증을 보장하기 위해 수술을 관리합니다. 0.7 할, 집게로 다시 피부를 들어 올려 – 멸균 마이크로 가위로 1.0 cm 길이의 절개를하고 퉁명스럽게 환자 유래 췌장암 조직의 일부가 삽입되는 작은 피하 주머니, (~ 8mm 3)을 준비합니다. 2 피부 스테이플 – 1을 사용하여 상처를 닫습니다. 칠일 후에 제거합니다. 자신의 새장에 마우스를 반환하고 다시 완전히 활성화 될 때까지 가열 패드 또는 가열 램프 아래에 보관하십시오. 종양 이식을 따르면, hunche, 종양의 성장 및 주름 장식 모피로 사망률을 발생의 일반적인 징후가 적어도 일주일에 두 번 마우스를 모니터D 자세 및 부동성. 종양이 200mm (3)의 평균 크기에 도달하면, 마우스를 무작위로 각 치료된다. IP 주사 (150 ㎎ / ㎏ BW)를 통해 또는 유사한 치료 효과와 마시는 물 (150 ㎎ / ㎏ BW)를 통해 매일 차량 또는 메트포르민을 관리합니다. 캘리퍼스를 이용하여 종양 부담을 모니터하고, 종양 부피는 일주일에 한 번 (종양 부피 측정 = 숨 × 폭 × 1/2 길이)를 계산한다. 종양이 직경 1cm에 도달 한 이상 지정된 마우스는 심한 통증이나 질병의 흔적을 보여주는 시작하면 마우스를 희생.