Assonale reclutamento mRNA e traduzione locali consentono assoni di rispondere agli stimoli extracellulari in maniera temporalmente e spazialmente acuta ^1. Intra-assonale sintesi proteica si comprende meglio nel contesto del neurosviluppo in cui svolge un ruolo cruciale nella crescita comportamento cono ^2-8, assone Pathfinding ^9-11 e retrogrado segnalazione ^12,13. Ma molto meno si sa circa il significato funzionale di assonale sintesi proteica nei neuroni post-sviluppo quando i livelli di mRNA e ribosomi assonale sono notevolmente ridotte ^14,15. Assoni vertebrati maturi sono stati a lungo pensato di essere traslazione attivo ^16. Tuttavia, studi recenti indicano che la traduzione locale viene riattivato negli assoni maturi in condizioni patologiche. Per esempio, un sottoinsieme di mRNA viene reclutato per assoni rigeneranti seguente è richiesta lesioni nervose e intra-assonale sintesi proteica per la corretta rigenerazione di questi assoni ^17. Inoltre, il nostro gruppo has dimostrato che specifici mRNA sono reclutati per assoni dopo l'esposizione locale per la malattia di Alzheimer peptide Ap _1-42, e la traduzione locale del fattore di trascrizione ATF4 è necessaria per propagare gli effetti neurodegenerativi di Ap _1-42 da assoni al soma neuronale ^18. Infine, le analisi di throughput elevato hanno rivelato che gli assoni maturi hanno un trascrittoma più complesso e dinamico di quanto previsto ^18-21, soprattutto in condizioni patologiche. Alla luce di questi studi, un metodo altamente sensibile e specifico per rilevare è necessario mRNA assoni localizzati nel sistema nervoso adulto.

Gran parte del lavoro sul reclutamento mRNA e traduzione locali negli assoni maturi è stata eseguita su neuroni in coltura. Ciò è particolarmente vero per le analisi del trascrittoma in quanto esistono metodi di coltura specializzate che permettono l'isolamento degli assoni dalla somato-dendritica vano ^18-20. Anche se questi studi hanno dato ins preziosiight nel ruolo della traduzione locale di assoni maturi, la questione se i neuroni in coltura rappresentano fedelmente la situazione in vivo o se mRNA reclutamento è una risposta di adattamento degli assoni a condizioni di coltura è ancora aperta. Pochi studi hanno fornito prove di mRNA assunzioni a maturare assoni in vivo. Ad esempio, la trascrizione che codifica per la proteina marcatore olfattivo è stato rilevato in assoni nei neuroni sensoriali adulti ^22. Un transgene contenente la 3 'UTR di β-actina mRNA viene trasportato assoni nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico in topi e si traduce localmente dopo periodi di sviluppo ^23. Lamin b2 mRNA è localizzato a assoni retinici in Xenopues laevis girini e il suo esaurimento colpisce assone manutenzione dopo lo sviluppo assonale ^21. Interferenza con il trasporto assonale della codifica mRNA per citocromo C ossidasi IV altera il comportamento del mouse ^24. Infine, ATF4 mRNA si trova in adultiXON di topi e cervelli umani nel contesto di Ap _1-42 indotta neurodegenerazione ^18.

Alta velocità effettiva analisi del trascrittoma hanno dimostrato di essere utile per identificare i profili di mRNA in assoni isolati in vitro, ma hanno limitazioni per studi in vivo in quanto nei tessuti interi assoni non si trovano mai isolatamente, ma mescolati con i corpi cellulari neuronali, cellule gliali e altri tipi di cellule. Pertanto, tali analisi devono essere combinati con tecniche di imaging che confermano la localizzazione subcellulare di mRNA. RNA ibridazione in situ (ISH RNA) permette la rilevazione e visualizzazione di specifiche sequenze di RNA in cellule e tessuti. Tuttavia, i saggi originali RNA ISH erano adatte solo per l'identificazione di RNA altamente abbondanti ^25, che è raramente il caso di mRNA assoni localizzate. Negli ultimi decenni ci si è messi in via di sviluppo nuove tecnologie che permettono la rilevazione di mRNA a livello di singola molecola <sup> 25,26. Ad esempio, Singer e colleghi hanno sviluppato le sonde ISH per rilevare mRNA in singole cellule, che consiste in 5 non sovrapposti fluorescente 50-mers (per i dettagli si riferiscono al ^27). La differenza principale tra le tecniche sopra menzionate e quella qui descritta è che la successiva utilizza 20 doppia Z-struttura (non lineare) sonde che tipicamente colpiscono ~ 1 kb regione del RNA di interesse garantire specificità e bassi livelli di fondo. Le sonde sono poi ibridati con preamplificatore e amplificatore sequenze che vengono finalmente fluorescente o coniugati con enzimi che consentono reazioni cromogeni. Questi passaggi di amplificazione migliorare il rapporto segnale-rumore, rispetto ad altre tecnologie ISH ^28. Qui si descrive due protocolli che utilizzano RNAscope combinato sia con fluorescenza immunocitochimica o con coloranti istologici che permettono di contrasto assonale. Entrambi i protocolli sono adatti per visualizzare la localizzazione assonale di ATF4 mRNA in mo adultiutilizzare e cervelli umani.