고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em> 현장에서</em> 하이브리드
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
mRNA를 자주 척추 축삭에 지역화 및 로컬 번역 축삭 길 찾기 또는 개발 과정과 postdevelopmental 기간에 유지 보수, 수리 또는 신경 퇴행에 대한 분기가 필요합니다. 높은 처리량 분석은 최근 축색 돌기 이전에 예상했던 것보다 더 역동적이고 복잡한 사체을 가지고 계시했다. 이러한 분석은, 그러나 대부분의 축삭이 somato-수지상 구획에서 고립 될 수있다 배양 신경 세포에서 수행되었다. 이는 생체 내 전체 조직의 이러한 격리를 달성하는 것은 사실상 불가능하다. 따라서, 전체 동물에서의 mRNA 및 기능적 관련성의 채용을 검증하기 위해, 전 사체 분석은 이상적 동일계에서의 mRNA의 시각화를 허용 기법과 결합되어야한다. 최근에, 단일 분자 수준에서의 RNA를 검출 ISH 신규 기술이 개발되었다. mRNA는 세포 내 위치 파악을 분석 할 때 특히 중요이후 지역화의 RNA는 일반적으로 낮은 수준에서 찾을 수 있습니다. 여기에서 우리는 새로운 고감도 RNA ISH 기술을 사용하여 axonally 지역화의 mRNA의 검출을위한 두 개의 프로토콜을 설명합니다. 우리는 성숙 마우스와 인간의 두뇌의 생체 내에서 축삭에 ATF4의 mRNA의 채용을 확인하기 위해 형광 면역 조직 또는 조직 학적 염료를 사용하여 축삭 Counterstain과 함께 RNAscope ISH를 결합했다.
Introduction
축삭 mRNA의 모집 및 지방 번역은 시간적으로 공간적으로 급성으로 1 세포 외 자극에 반응하는 축삭 수 있습니다. 인트라 축삭 단백질 합성은 가장 엑손 9-11과 길 찾기를 역행 12,13 시그널링이 성장 원추 동작 2-8에서 결정적인 역할을 신경 발달의 맥락에서 이해된다. 축삭 mRNA와 리보솜 수준이 크게 14,15 감소하지만 훨씬 적은 포스트 발달 신경 축삭에서 단백질 합성의 기능적 중요성에 대해 공지되어있다. 성숙한 척추 축삭이 긴 16 병진 비활성 것으로 생각되고있다. 그러나 최근의 연구는 지역의 번역이 병적 인 상태에서 성숙 축삭에서 활성화되어 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 서브 세트의 mRNA가 신경 손상과 인트라 축삭 단백질 합성은 이들 축색 돌기 (17)의 정확한 재생을 위해 요구되는 다음 재생 축삭을 모집한다. 또한, 우리 그룹의 하S는 알츠하이머 병 펩타이드 Aβ 1-42, 그리고 전사 인자 ATF4의 지역 번역 로컬 노출이 신경 소마 (18)에 축삭에서 Aβ 1-42의 신경 퇴행성 효과를 전파하는 데 필요한 후 특정의 mRNA가 축색 돌기에 채용되는 것을 보여 주었다. 마지막으로, 높은 처리량 분석 성숙한 축삭 특히 병리 적 상태하에, 18-21 예상보다 더 복잡하고 동적 사체가 있다고 밝혀졌다. 이러한 연구의 견지에서, 고감도 및 구체적인 방법은 성인 신경계 axonally 지역화 mRNA를 필요 검출.
mRNA의 모집과 성숙 축삭의 지역에 번역 작업의 대부분은 배양 된 신경 세포에서 수행되었다. 전문 배양 방법 somato-수지상 구획 18-20에서 축삭의 분리를 허용하는 존재하기 때문에 전 사체 분석을 위해 이것은 특히 사실이다. 이러한 연구는 가치있는 기능을 제공하고 있지만성숙한 축삭에서 현지 번역의 역할에 ight는 질문 배양 신경 세포 충실 생체 내에서 상황을 나타내는 또는 mRNA의 모집 배양 조건에 축삭의 적응 응답이 경우 여전히 열려 있는지 여부. 몇몇 연구는 생체 내에서 축삭을 성숙 mRNA의 모집의 증거를 제공했다. 예를 들어, 후각 마커 단백질을 코딩하는 전 사체는 성인 감각 뉴런 22 축삭에서 검출되었다. β – 굴지의 mRNA의 3 'UTR을 포함하는 형질 전환 생쥐에서 말초와 중추 신경계 신경 세포의 축색 돌기로 이송하고, 로컬 개발 기간 23 후 변환됩니다. Xenopues가 올챙이를 laevis의에서 라민 B2 mRNA의 망막 축삭에 지역화되고 그 고갈 축삭 개발 (21) 후 축삭 유지 보수에 영향을 미친다. 사이토 크롬 C 산화 효소 IV에 대한 mRNA의 부호화의 축삭 전송에 대한 간섭은 마우스 (24)의 동작을 변경한다. 마지막으로, ATF4의 mRNA는 성인에서 발견된다Aβ 1-42의 맥락에서 쥐와 인간의 두뇌 xons은 신경 퇴행 (18) – 유도.
높은 처리량 사체의 분석은 시험 관내에서 격리 된 축삭의 mRNA의 프로필을 확인하지만 축삭이 단독으로 발견하지만 신경 세포 기관, 아교 세포와 다른 세포 유형과 혼합 결코 전체 조직에 있기 때문에 생체 내 연구에 대한 제한을 가지고 유용한 것으로 입증되었다. 따라서, 이러한 분석의 mRNA의 세포 내 위치 파악을 확인 이미징 기술과 결합되어야한다. 현장 하이브리드 (RNA ISH)에서 RNA는 세포와 조직의 특정 RNA 서열의 검출 및 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 원래 RNA ISH 분석은 거의 axonally 지역화의 mRNA의 경우입니다 매우 풍부한 RNA를 (25)의 식별에 적합했다. 노력을 증가 지난 수십 년 동안 단일 분자 수준에서의 mRNA의 검출을 허용 새로운 기술 개발에 투입되었을 <suP> (25), (26). 예를 들어, 가수와 동료에 구성된 하나의 세포에서의 mRNA를 검출하기 위해 ISH 프로브를 개발 한 5 겹치지 않는 형광 (자세한 내용은 27를 참조하십시오) 50 머 레이블. 위에서 언급 한 기술 및 여기에 설명 된 것과의 주요 차이점은 이후 20 번 Z 구조 (되지 선형)는 전형적으로 관심 보장 특이성 및 낮은 배경 레벨의 RNA의 ~ 1킬로바이트 영역을 대상으로 프로브를 사용하는 것이다. 프로브는 다음 마지막으로 형광 표지 또는 발색 반응을 허용 효소가 결합되어 프리 앰프와 앰프 순서와 하이브리드있다. 이러한 증폭 단계 ISH 다른 기술 (28)에 비해 신호대 잡음비를 개선한다. 여기에서 우리는 형광 면역 세포 또는 축삭으로 대조를 허용하는 조직 학적 염료 중 결합 RNAscope를 사용하여 두 개의 프로토콜을 설명합니다. 두 프로토콜은 성인 개월에 ATF4의 mRNA의 축삭 현지화를 시각화하기에 적합사용하고 인간의 두뇌.
Protocol
Representative Results
Discussion
이보고에서는 axonally 지역화 ATF4 mRNA를 검출 고해상도 ISH 기술의 사용을 설명한다. 이 이전 발표 된 연구는이 기술이 조직 또는 전체 배아 (33)에 항체 기반의 단백질 검출과 호환되는지 보여준다. 중요한 것은 최근 해마 뉴런의 수상 돌기 (34) 내의 아크의 mRNA의 검출을 위해 사용되었다. 또한, 조직 학적 염색 용 염료와 조합 될 수있다. 마지막으로, 다수의 RNA를 대상 <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
Referências
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
