Hel-dyr Imaging og strømningscytometriske Teknikker for analyse av Antigen-spesifikke CD8 + T celle responser etter Nanopartikkel Vaksinasjon

Tradisjonell vaksineutvikling har i hovedsak benyttet empirisk tilnærming med prøving og feiling. Men med den siste utviklingen av et bredt utvalg av biomaterialer og oppdagelsen av molekylære determinanter for aktivering av immunsystemet, er det nå mulig å rasjonelt designe vaksineformuleringer med biofysiske og biokjemiske signaler avledet fra patogener ^1,2. Spesielt har ulike partikkel stoffet levering plattformer blitt undersøkt som vaksinebærere som de kan være co-lastet med subenhet antigener og immunstimulerende midler, beskytte vaksinekomponenter fra degradering, og styrke deres co-levering til antigenpresenterende celler (APC) bosatt i lymfe noder (LNS), og dermed maksimere immun stimulering og aktivisering ^3-5. I denne rapporten beskriver vi syntesen av en "patogen-ligne" nanopartikler system, betegnet interbilayer-tverrbundne multilamellære vesikler (ICMVs), som tidligere er vist som en potent vaksine plattform;m for utløsning av robust cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og humorale immunresponser hos både systemiske og slimhinne vevsområder ^6-9. Spesielt oppnådde vaksinering med ICMVs vesentlig forbedret serum IgG-nivåer mot malaria antigen, sammenlignet med vaksinering med konvensjonelle hjelpestoffer (for eksempel alun og Montanide) ⁷ og også utløst sterke CTL-responser mot kreftceller og virale smittemodeller i mus ^9. Her, ved hjelp ICMVs som modell vaksine nanopartikkel-system, beskriver vi metoder for karakterisering av vaksinenanoformuleringer, inkludert partikkelstørrelse og Zeta potensial målinger og sporing av partikkel trafficking til drenering LNS (dLNs) utnytte confocal avbildning av cryosectioned vev ^7. I tillegg presenterer vi en hel-animalsk bildebasert metode for å analysere utvidelse av CTL-responser i mus etter adoptiv overføring av luciferase-uttrykkende antigen-spesifikke CD8 + T-celler ^9,10. Til slutt, vi despiss tetramer farging av perifere mononukleære blodceller (PBMC) for langsgående måling av endogent T-celleresponser hos mus vaksinert med nanopartikler ^6,9.

ICMVs er et lipid-baserte nanopartikkel-formulering syntetisert ved kontrollert fusjon av liposomer inn i enkle multilamellære strukturer, som deretter kjemisk stabilisert ved tverrbinding av maleimid-funksjonalisert fosfolipid hodegruppene i lipidlagene med ditiol tverrbindere ^6. Når ICMVs er syntetisert, kan en liten brøkdel av nanopartikler kan brukes til å bestemme partikkelstørrelse og zeta potensial (dvs. overflateladningen av partikler) med en dynamisk lysspredning (DLS) system og et zeta potensial analysator. DLS måler forandringer i lysspredningen i partikkelsuspensjoner, som tillater bestemmelse av diffusjonskoeffisienten og den hydrodynamiske størrelse av partikler ^11. Oppnå konsistente partikkelstørrelse fra parti til parti syntese er kritiskSiden partikkelstørrelsen er en av de viktigste faktorene som påvirker lymfatisk drenering av vaksine partikler til dLNs og påfølgende cellulært opptak av APC ^12,13. I tillegg kan zeta-potensialet oppnås ved å måle partikkelhastigheten når en elektrisk strøm påtrykkes, som tillater bestemmelse av den elektroforetiske mobilitet av partikler og partikkeloverflateladning ^11. Å sikre konsistente zeta-potensialverdier partikler er viktig fordi overflateladningen på partiklene bestemmer kolloidal stabilitet, som har direkte innvirkning på partikkel dispersjon under lagring og etter in vivo administrering ^14,15. For å spore partikkel lokalisering til dLNs kan ICMVs merkes med ønskede fluoroforene inkludert lipofile fargestoffer og kovalent-merket antigener. Etter immunisering, kan mus avlives på ulike tidspunkter, dLNs resected, cryosectioned, og analysert med konfokalmikroskopi. Denne teknikken tillater visualisering av lymfatisk Draining av både nanopartikkel vaksinebærere og antigen til dLNs. Vevssnittene kan i tillegg være farget med fluorescensmerkede antistoffer og brukes for å oppnå mer informasjon, slik som typer av celler assosiert med antigenet, og dannelsen av germinale sentre som vi har vist tidligere ^7.

Når partikkelen syntese er optimalisert og omsetning til de dLNs er bekreftet, er det viktig å validere utløsning av CTL in vivo ekspansjon. For å analysere utløsning av antigen-spesifikke CD8 + T-celler i respons til nanopartikler vaksinering, har vi benyttet en modell antigen, ovalbumin (OVA), med OVA _257-264 peptid (SIINFEKL) immunodominant CD8 + T-celle epitop, som tillater detaljerte immunologiske analyser av antigen-spesifikke T-celle-responser for første vaksineutvikling ^16,17. Spesielt å avhøre dynamikken i ekspansjon og migrering av antigen-spesifikke CD8 + T-celler, har vi generert endobbelt-transgen musemodell ved å krysse ildflue luciferase-uttrykkende transgene mus (Luc) med OT-I transgene mus som har CD8 + T-celler med T-cellereseptoren (TCR) spesifikk for SIINFEKL (i forbindelse med H-2K ^b). Fra disse OT-I / Luc mus, luciferase-uttrykkende, OT-I CD8 + T-celler kan bli isolert og preparert for adoptiv overføring til naive C57BL / 6-mus. Når seeded, vil vellykket immunisering med OVA-holdige nanopartikler resulterer i utvidelse av den utskilte T-celler, som kan spores ved å overvåke Bioluminescens signal med et helt dyr avbildningssystem ^9,10. Denne ikke-invasiv helkropps avbildningsteknikk har vært brukt sammen med andre virale eller tumorantigener i det siste ^18-20, avslørende prosessene som er involvert i T-celle-ekspansjon i lymfevev og spredning til perifert vev på en langsgående måte.

Komplement til analyse av adoptivt overført antigen-spesifikke CD8 + T-celler, endogenooss T-celleresponser etter vaksinering kan undersøkes med peptid-hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) tetramer assay ^21, hvor et peptid-MHC-komplekset tetramer, bestående av fire fluorofor-merket MHC-klasse I-molekyler fylt med peptidepitoper, benyttes å binde TCR og etikett CD8 + T-celler i en antigen-spesifikk måte. Den peptid-MHC tetramer assay kan utføres enten i terminal obduksjon studier for å identifisere antigen-spesifikke CD8 + T-celler i lymfoid og perifert vev eller i langsgående studier med perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble oppnådd fra serieblodprøver. Etter farging lymfocytter med peptid-MHC-tetramer, strømningscytometri-analyse blir utført for detaljerte analyser på fenotypen av CTL eller kvantifisering av deres frekvens mellom CD8 + T-celler.