Comet analys som ett indirekt mått på system oxidativ stress

Studier på komet analys utförs vid universitetet i Basel, var Ögonkliniken godkänts av den lokala etiska kommittén i Basel 1. Beredning av reagenser Förbered Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS) (Ca ++, Mg ++ fri) lösning genom att tillsätta PBS (1 L-paket) och 990 ml dH 2 O till media. Justera pH till 7,4. Förvara vid RT. Bered lyserande lösning: För att förbereda 1000 ml tillsätt 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) och 10 mM Trizma bas (1,2 g) i dH 2 O. Bered elektroforesbuffert (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) genom tillsats av 30 ml av 10 M NaOH och 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs till 1500 ml dH 2 O och blanda väl. Den totala volymen är beroende gelboxen kapaciteten. Före användning, mäta pH av bufferten för att säkerställa ett pH av> 13. Bered neutraliseringsbuffert innehållande 0,4 M Tris (48,5 g tillsatt ~ 800 ml dH 2 O, justera pH till 7,5), koncentrerades (& #62, 10 M HCI) i 1000 ml med dH 2 O. Förvara lösningen vid RT. Förbered färglösningen. Till Etidiumbromid (EtBr; 10x Lager, 20 | ig / ml) tillsätt 10 mg EtBr i 50 ml dH 2 O och lagra vid RT. För 1x Lager – Blanda 1 ml med 9 ml dH 2 O. FÖRSIKTIG! Handtag EtBr med tillräcklig försiktighet eftersom det är ett känt cancerframkallande. 2. Isolering av leukocyter Erhålla humana blodprover (20 ml) med anti-koagulant såsom heparin med användning av venös punktering. Separera lymfocyterna med hjälp av en densitetsgradient cellseparator såsom Histopaque. I korthet, späd blodet i förhållandet 1: 1 med PBS eller RPMI (utan FBS) och skiktet över 600 | il cellseparatorn vätska. Centrifugera 1800 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Aspirera "buffy" coat in 3-5 ml PBS / RPMI och centrifugerades vid 300 xg under 10 min för att pelletera lymfocyter. Hämta lymfocyter från strax över gränsen mellan PBS (RPMI) Och cellseparator vätska, med hjälp av en pipett. Avlägsna de leukocyt banden från gränsytan mellan plasma och cellseparatorn vätskeskikt i varje rör och samla upp i en 50 ml tub. Bringa den totala volymen till 50 ml med kall Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM). Tvätta cellsuspensionen tre gånger med DMEM vid 300 xg under 10 minuter. Räkna det totala antalet celler genom att använda en Haemocytometer. Häng cellerna i PBS och aliquote i mikrocentrifugrör vid 10 7 celler / rör. Pipett 0,4 ml av celler i en 5 ml plastengångs rör. Tillsätt 1,2 ml 1% låg gelbildande temperatur agaros vid 40 ° C. Blanda och snabbt och pipettera 1,2 ml av cellsuspensionen på agaros-täckta ytan av en förbelagd bild. Undvik att producera bubblor. Låt agarosen att gela under omkring 2 min. Var konsekvent med tiden och temperaturen som används för gelning, och se till att agarosen är helt inställd innan nedsänkning i lyslösning. Efter fullt set, dränka in lyseringslösning på ~ 4 ºC. 3. Lysis och Elektrofores OBS: Det beskrivna förfarandet är för elektrofores under pH> 13 alkaliska betingelser. Efter åtminstone 2 h vid ~ 4 ° C, försiktigt bort diabilder från lyse Solution. Placera objektglasen sida vid sida på den horisontella gelboxen nära den ena änden, att skjuta dem så nära varandra som möjligt. Fyll buffertreservoarerna med nybakade pH> 13 elektroforesbuffert tills vätskenivån täcker bilderna (undvika bubblor över agarosen) helt. Låt objektglasen sitta i alkalisk buffert för 20 min för att medge avlindning av DNA och expression av alkali-labil skada. Slå på strömförsörjningen till 25 volt (~ 0,75 V / cm) och justera strömmen till 300 mA genom att höja eller sänka buffertnivån. Elektrofores objektglasen i 30 minuter. Stäng av strömmen. Lyft försiktigt bilderna från bufferten och psnöra på en dräneringstråg. Drop klokt belägga objektglasen med neutraliseringsbuffert. Låt bilderna att sitta i minst 5 minuter. Tappa diabilder och upprepa ytterligare två gånger. Färga glasen med 80 pl 1x Etidiumbromid (EtBr) och låt stå i 5 minuter och sedan doppa i kylt destillerat vatten för att avlägsna överskott fläcken. Placera sedan en täck över bilden och lagra dem omedelbart. Store glider i en månad vid rumstemperatur under torra förhållanden. OBS: Andra DNA-fläckar (t.ex. SYBR-grön) kan också användas. Varning! skyddshandskar som de flesta färgämnen är mutagena. 4. Kvantifiering av DNA-brott För att visualisera DNA-skador, observera EtBr-färgade DNA glider under en 40X objektiv fluorescerande mikroskop. Bedöm DNA-skada kvantitativt i cellerna genom att mäta längden av DNA-migration och den procentuella andelen av migrerade DNA (Figur 1A). Kvantifiera DNA-skada (Figur 1B) av bak- ögonblick och Olive-Moment. Definitioner av Tail-Moment och Olive -Moment har tidigare fått 8-10. OBS: Enligt vår erfarenhet är det tillräckligt för att hålla fast vid en av parametrarna. Cellerna fotograferas genom att ställa in automatiska verktyg som skannar över objektglas och fotografier celler. Kvantifiering av DNA-brott kan göras genom bildanalys programpaket. Det finns flera olika mjukvarupaket som är skräddarsydda för att fånga bilden av celler och kvantifiera skador på DNA. Vi rekommenderar att du använder samma programpaket hela experimentet. Den laboratorietekniker identifierar intakt cell eller komet som görs på datorn och klickar med musen på den. Kometen eller intakt cell sedan automatiskt gjorde.