Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Estudios sobre ensayo cometa realizadas en la Universidad de Basilea, Departamento de Oftalmología fueron aprobados por el Comité Ético Local de Basilea 1. Preparación de los reactivos Prepare la solución mediante la adición de PBS (1 L de paquetes) y 990 ml de dH2O a los medios de comunicación Tampón fosfato salino de Dulbecco (PBS) (libre de Ca ++, Mg ++). Ajustar el pH a 7,4. Guarde a temperatura ambiente. Preparar la solución de lisis: Para preparar 1000 ml Añadir NaCl 2,5 M (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) y 10 mM de base Trizma (1,2 g) en dH 2 O. Preparar tampón de electroforesis (300 mM NaOH / EDTA 1 mM) mediante la adición de 30 ml de NaOH 10 M y 7,5 ml de 0,2 M EDTA, QS para 1500 ml dH 2 O y mezclar bien. El volumen total depende de la capacidad de la caja del gel. Antes de usar, medir el pH del tampón para asegurar un pH> 13. Preparar tampón de neutralización que contiene 0,4 M Tris (48,5 gm añadido a ~ 800 ml dH2O, ajustar el pH a 7,5), se concentró (& #62; HCl 10 M) en 1000 ml con dH2O Guarde la solución a temperatura ambiente. Prepare la solución de tinción. Para bromuro de etidio (EtBr; 10x Stock, 20 mg / ml) añadir 10 mg de EtBr en 50 ml dH2O y almacenar a temperatura ambiente. Para 1x Acción – mezclar 1 ml con 9 ml dH2O PRUDENTE! Maneje con precaución EtBr adecuada ya que es un carcinógeno conocido. 2. Aislamiento de leucocitos Obtener muestras de sangre humana (20 ml) con anti-coagulante tales como la heparina usando punción venosa. Separar los linfocitos utilizando un separador de células en gradiente de densidad, tales como Histopaque. Brevemente, diluir la sangre en proporción 1: 1 con PBS o RPMI (sin FBS) y la capa de más de 600 l de líquido separador de células. Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar el escudo 'Buffy' en 3-5 ml de PBS / RPMI y se centrifugaron a 300 xg durante 10 min para sedimentar los linfocitos. Recuperar los linfocitos desde justo por encima de límite entre PBS (RPMI) Y el líquido separador de células, utilizando una pipeta. Retire las bandas de leucocitos desde la interfaz entre el plasma y las capas líquidas separador de células de cada tubo y recoger en un tubo de 50 ml. Llevar el volumen total a 50 ml con medio Eagle modificado de Dulbecco frío (DMEM). Se lava la suspensión celular tres veces con DMEM a 300 xg durante 10 min. Cuente el número total de células utilizando un hemocitómetro. Suspender las células en PBS y alícuotas en tubos de microcentrífuga a 10 7 células / tubo. Pipetear 0,4 ml de células en un tubo de plástico desechable de 5 ml. Añadir 1,2 ml 1% de agarosa de baja temperatura de gelificación a 40 ° C. Mezclar y rápidamente y pipetear 1,2 ml de suspensión celular sobre la superficie de agarosa-cubierto de un portaobjetos pre-recubiertos. Evitar la producción de burbujas. Deje que el gel de agarosa al por alrededor de 2 min. Sea consistente con el tiempo y la temperatura utilizada para la gelificación, y asegúrese de que agarosa está totalmente ajustado antes de sumergirse en la solución de lisis. Después plenamente set, sumergir en solución de lisis a ~ 4 ºC. 3. Lisis y Electroforesis NOTA: El procedimiento descrito es para la electroforesis en condiciones de pH> 13 alcalinas. Después de al menos 2 horas a ~ 4 ºC, retire con cuidado los portaobjetos de la solución de lisis. Lugar desliza de lado a lado en la caja de gel horizontal cerca de un extremo, deslizándolas tan cerca como sea posible. Llenar los depósitos tampón con tampón de pH> 13 electroforesis recién hecho hasta que el nivel del líquido cubre completamente las diapositivas (evitar burbujas sobre la agarosa). Deje diapositivas se sientan en el tampón alcalino durante 20 min para permitir el desenrollamiento del ADN y la expresión de daños alcalino-lábil. Encienda la fuente de alimentación de 25 voltios (~ 0,75 V / cm) y ajustar la corriente de 300 miliamperios subiendo o bajando el nivel de amortiguación. La electroforesis los portaobjetos durante 30 min. Desconecte la alimentación. Levante con cuidado las diapositivas de la memoria intermedia y pencaje en una bandeja de drenaje. Caída de la capa sabia las diapositivas con la neutralización de búfer. Permitir a las diapositivas para sentarse durante al menos 5 minutos. Escurrir las diapositivas y repetir dos veces más. Teñir las diapositivas con 80 l 1x bromuro de etidio (EtBr) y dejar actuar durante 5 minutos y luego se sumerge en agua destilada fría para eliminar el exceso de tinte. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y almacenarlos inmediatamente. Tienda desliza durante un mes a temperatura ambiente en un lugar seco. NOTA: Otras manchas de ADN (por ejemplo, SYBR-verde) puede también ser utilizado. ¡Precaución! usar guantes protectores como la mayoría de los tintes son mutagénicos. 4. Cuantificación de ADN Breaks Para visualizar el daño en el ADN, observar la diapositiva ADN teñido con EtBr bajo un microscopio de fluorescencia objetivo de 40X. Evaluar cuantitativamente el daño del ADN en las células mediante la medición de la longitud de la migración del ADN y el porcentaje de ADN migrado (Figura 1A). Cuantificar el daño del ADN (Figura 1B) por el momento cola- y Olive-moment. Definiciones de Cola-Momento y Olive -Moment previamente se les ha dado 8-10. NOTA: En nuestra experiencia es suficiente para pegarse por uno de los parámetros. Las células son fotografiadas mediante el establecimiento de la herramienta automatizada que escanea sobre las células portaobjetos de microscopio y fotografías. Cuantificación de roturas en el ADN se puede hacer por paquetes de software de análisis de imagen. Hay varios paquetes de software diferentes que se hacen de encargo para capturar la imagen de las células y cuantificar el daño del ADN. Se recomienda utilizar el mismo paquete de software de todo el experimento. El técnico de laboratorio identifica la célula intacta o un cometa que se anotaron en el equipo y hace clic con el ratón sobre ella. La célula cometa o intacta después se anotó de forma automática.