Comet assay måler DNA pauser, forårsaket av ulike faktorer. Dersom alle faktorene (unntatt oksidativt stress) som forårsaker DNA-skade blir holdt konstant, er mengden av DNA-skade en god indirekte parameter for oksidativt stress. Målet med denne protokollen er å bruke kometmetoden for indirekte måling av oksidativt stress.
Høyere eukaryote organismer ikke kan leve uten oksygen; ennå, paradoksalt nok, kan oksygen være skadelig for dem. Den oksygenmolekyl er forholdsvis kjemisk inert fordi den har to uparede elektroner befinner seg i forskjellige pi * anti-bindings orbitaler. Disse to elektroner har parallelle spinn, noe som betyr at de roterer i samme retning om sine egne akser. Dette er grunnen til oksygenmolekylet er ikke svært reaktive. Aktivering av oksygen kan skje ved to forskjellige mekanismer; enten ved reduksjon via en elektron gangen (enverdig reduksjon), eller ved absorpsjon av tilstrekkelig energi for å reversere spinn av en av de uparede elektroner. Dette resulterer i produksjon av reaktive oksidative arter (ROS). Det finnes en rekke måter på hvilke det menneskelige legeme eliminerer ROS i sin fysiologiske tilstand. Hvis ROS produksjon overstiger reparasjonskapasitet, oksidativt stress resultater og skader forskjellige molekyler. Det finnes mange forskjellige metoder som oksidativt stress kan være megasured. Dette manuskriptet fokuserer på en av metodene nevnt celle gelelektroforese, også kjent som "komet assay", som tillater måling av DNA-bryter. Dersom alle faktorer som er kjent for å forårsake DNA-skade, annet enn oksidativt stress holdes konstant, er mengden av DNA-skade målt ved komet assay en god parameter for oksidativt stress. Prinsippet er enkelt og bygger på det faktum at DNA-molekyler som er negativt ladet. Et intakt DNA-molekyl har en så stor størrelse at det ikke migrere under elektroforese. DNA-bryter, men hvis tilstede resultat i mindre fragmenter som beveger seg i det elektriske feltet mot anoden. Mindre fragmenter vandrer raskere. Som fragmentene har forskjellige størrelser det endelige resultat av elektroforese er ikke et distinkt linje, men snarere som en sammenhengende form av en komet. Systemet muliggjør en kvantifisering av den resulterende "Comet", og således av DNA-brudd i cellen.
Comet assay ble først utviklet av svenske forskere Ostling og Johanson 1. DNA er en negativt ladet molekyl. Under elektroforese, mindre, skadede DNA-fragmenter reise raskere mot et positivt ladet anode to. Jo mindre DNA-fragmenter, for raskere sin vandring mot anoden danner en typisk "komet" med et "hode" som består av intakt og uskadet DNA og en "hale" som består av skadet DNA-fragmenter tre. Skadet DNA kan repareres ved forskjellige mekanismer i kroppen 4, som holder generering av DNA-bryter ganske balansert 5. Hvis, derimot, er balansen til fordel for DNA-bryter, kan pausene akkumulere og vil til slutt bidra til utviklingen av en sykdom.
Vårt DNA lider ca 0.000165% skade på et gitt tidspunkt 6. Enkelttrådet DNA bryter referere til en feil på en av de to tråder av DNA-dobbeltspiralenmens doble DNA pauser er forårsaket når begge tilnærmingene av DNA dobbeltspiralen er skadet. Det er forskjellige faktorer som kan øke mengden av DNA-bryter på et gitt tidspunkt, slik som i en alder av cellen, sigarettrøyk, forskjellige medikamenter eller oksidativt stress 7-9. Dersom alle faktorer som fører til forbedrede DNA pauser holdes konstant, da kvantifisering av DNA bryter ved hjelp av komet-analysen er en god indirekte parameter for oksidativt stress.
Metoden for kometmetoden brukes stadig mer i dag i medisin inkludert oftalmologi. En grunn til dette er at oksidativt stress er mer og mer anerkjent som en patogenetisk mekanisme for ulike sykdommer 8-11 og kometmetoden er en metode som oksidativt stress kan indirekte kvantifiseres.
Svenske forskere Ostling og Johanson var den første i sitt felt å bruke komet analyse for å kvantifisere DNA-skader i celler 1. De nøytrale betingelser at de to forskerne anvendes imidlertid bare tillot påvisning av dobbelttrådete DNA pauser. Singh et al. Senere tilpasset analysen for bruk under alkaliske betingelser, som produserte en sensitiv versjon som kunne vurdere dobbelt- og enkelt-trådete DNA-bryter og detektere alkali-labile områder 12. Siden den første utvikling, er analysen blitt modifisert på forskjellige trinn for å gjøre det egnet for å vurdere typer DNA-skade i forskjellige celletyper 13-15.
Som med alle teknikker, betaler strenge oppmerksomhet til tekniske detaljer er viktig å få nøyaktige resultater 16. Basert på vår erfaring, best resultat oppnås hvis alle metodisk steg fra løsning forberedelse til kometen kvantifisering-er utført av ekspert laboratorium technicians. Bruken av fersk og riktig forberedt media, tilstrekkelig pipettering teknikker, presis timing og (som tidligere nevnt i resultatene delen) bruk av nylagede leukocytter er avgjørende for lysering og gel elektroforese å oppnå nøyaktige resultater 17.
Alle de individuelle trinnene i denne analysen er like viktige for å oppnå pålitelige resultater. 16 Generelt er de beste resultater oppnås dersom hver enkelt metodiske trinn fra fremstillingen inntil oppløsningen komet kvantifisering er utført av ekspert lab technicians.Important synes bruk av friske og riktig forberedt media , tilstrekkelig pipettering teknikker, presis timing og som allerede nevnt i resultatene delen bruk av nylagede leukocytter for lysering og gel-elektroforese for å oppnå tilfredsstillende resultater fra analysen 17.
Som gjør andre metoder, har kometen analyseteknikken sin fortrinntages og ulemper. Å være en følsom metode, er analysen sårbare for faktorer (for eksempel UV lys) som kan utfylle DNA pauser og dermed påvirke resultatene. Enhver faktor som kan forsterke oksidativt stress, bortsett fra at det som blir undersøkt, bør unngås. Stressfaktorer kan øke nivået av oksidativt stress, ikke bare i leukocytter, men også i alle andre blod medier og lymfocytter. Som nevnt tidligere er det mange forskjellige og mer direkte måter å måle oksidativt stress 18,19. Kometen analysen er en av mange metoder som har visse fordeler. Disse inkluderer den relative lave kostnader, små antall celler som kreves (<10 000 celler), og dermed de små blodprøver som kreves per pasient, den relative kort tid som kreves for å kvantifisere DNA-skade i celler (ca. 3 dager), dets følsomhet og dens utbredt anvendbarhet til asses DNA-skader i ulike celletyper. I det siste velger vi å jobbe med leukocytter siden vi hadde erfaring med dennecelle-type, og det var anvendelig for den bestemte undersøkelsen planlagt. En annen fordel med kometmetoden er at den kan brukes til å detektere forskjellige typer og nivåer av DNA-skade, og kan således anvendes på forskjellige andre områder av undersøkelser i tillegg til oksidativt stress slik som DNA-reparasjons studier, kosttilskudd forsøk eller genotoksisitetsstudier.
Oksidativt stress er nå anerkjent som å spille en avgjørende rolle i patogenesen av flere sykdommer. Den kometanalysemetoden, mens en av mange måter å måle oksidativt stress 18,19, er relativt enkel, allsidig og billig. Når mestret, kan denne metoden brukes i alle områder av medisin der oksidativt stress spiller rollen 8-10,20,21.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke LHW Stiftung, i Triesen Liechtenstein, for økonomisk støtte til vår forskning på oksidativt stress.
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |