Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Studi sul test della cometa eseguite presso l'Università di Basilea, Dipartimento di Oftalmologia sono stati approvati dal Comitato Etico Locale di Basilea 1. Preparazione dei reagenti Preparare Dulbecco tampone fosfato (PBS) (Ca ++, Mg ++ libero) soluzione aggiungendo PBS (1 L confezione) e 990 ml di dH 2 O ai media. Regolare il pH a 7,4. Conservare a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di lisi: Per preparare 1.000 ml aggiungono 2,5 M NaCl (146,1 g), EDTA 100 mm (37,2 g) e 10 Trizma mm base (1,2 g) in dH 2 O. Preparare buffer per elettroforesi (NaOH 300 mm / 1 mM EDTA) con l'aggiunta di 30 ml di NaOH 10 M e 7,5 ml di 0,2 M EDTA, qb a 1500 ml dH 2 O e mescolare bene. Il volume totale dipende dalla capacità di dialogo gel. Prima dell'uso, misurare il pH del tampone per assicurare un pH> 13. Preparare tampone neutralizzazione contenente 0,4 M Tris (48.5 gm aggiunto a ~ 800 ml dH 2 O, aggiustare il pH a 7,5), concentrato (& #62; 10 M HCl) a 1000 ml con dH 2 O. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Preparare soluzione colorante. Per etidio bromuro (EtBr, 10x Archivio, 20 mg / ml) aggiungere 10 mg di EtBr in 50 ml di dH 2 O e conservare a temperatura ambiente. Per 1x Archivio – mescolare 1 ml con 9 ml dH 2 O. PRUDENTE! Maneggiare EtBr con adeguata cautela in quanto è un noto cancerogeno. 2. Isolamento dei leucociti Ottenere campioni umani di sangue (20 ml) con anticoagulante come l'eparina mediante puntura venosa. Separare i linfociti utilizzando un separatore cellulare gradiente di densità come Histopaque. Brevemente, diluire il sangue in rapporto 1: 1 con PBS o RPMI (senza FBS) e lo strato di oltre 600 microlitri separatore cellulare liquido. Centrifugare 1.800 xg per 20 min a 4 ° C. Aspirare il coat 'buffy' in 3-5 ml di PBS / RPMI e centrifugato a 300 xg per 10 minuti per ottenere il pellet linfociti. Recuperare i linfociti da appena sopra confine tra PBS (RPMI) E separatore cellulare liquido, con una pipetta. Rimuovere le bande leucociti dall'interfaccia tra il plasma e il separatore di cella strati liquidi di ciascun tubo e raccogliere in una provetta da 50 ml. Portare il volume totale di 50 ml con il freddo di Dulbecco modificato (DMEM). Lavare la sospensione cellulare tre volte con DMEM a 300 xg per 10 min. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro. Sospendere le cellule in PBS e aliquote in provette da microcentrifuga a 10 7 cellule / tubo. Pipettare 0,4 ml di cellule in 5 ml di plastica tubo usa e getta. Aggiungere 1,2 ml di 1% a bassa temperatura di gelificazione agarosio a 40 ° C. Mescolare e rapidamente e pipettare 1,2 ml di sospensione cellulare sulla superficie agarosio-coperto di un vetrino pre-rivestite. Evitare la produzione di bollicine. Lasciare che il agarosio di gel per circa 2 minuti. Essere coerenti con il tempo e la temperatura utilizzata per la gelificazione, e garantire che agarosio sia completamente impostata prima di immergere in soluzione di lisi. Dopo completamente set, immergere in soluzione lisante a ~ 4 ° C. 3. Lysis e elettroforesi NOTA: La procedura descritta è per elettroforesi in condizioni di pH> 13 alcaline. Dopo almeno 2 ore a ~ 4 ° C, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione di lisi. Collocare i vetrini affiancati sulla scatola gel orizzontale vicino ad una estremità, scorrevole come vicino possibile. Riempire i serbatoi tampone con appena fatto tampone pH> 13 elettroforesi fino a quando il livello del liquido copra completamente le diapositive (evitare bolle sul agarosio). Lasciare diapositive sedersi in tampone alcalino per 20 min per consentire lo svolgimento del DNA e l'espressione di danni alcali-labili. Attivare alimentazione a 25 volt (~ 0,75 V / cm) e regolare la corrente a 300 milliampere alzando o abbassando il livello del buffer. Elettroforesi i vetrini per 30 min. Spegnere l'alimentazione. Sollevare delicatamente le diapositive dal buffer e ppizzo su un vassoio di scarico. Eliminare cappotto saggio i vetrini con la neutralizzazione Buffer. Lasciare i vetrini a sedere per almeno 5 minuti. Scolare diapositive e ripetere altre due volte. Colorare i vetrini con 80 microlitri 1x etidio bromuro (EtBr) e lasciar riposare per 5 minuti e poi immergere in acqua distillata fredda per eliminare l'eccesso macchia. Poi posto un vetrino sul vetrino e archiviare immediatamente. Conservare i vetrini per un mese a temperatura ambiente in condizioni di asciutto. NOTA: Altri macchie DNA (ad esempio, SYBR-verde) può essere utilizzato anche. Attenzione! indossare guanti di protezione, come la maggior parte delle tinture sono mutageni. 4. Quantificazione delle rotture del DNA Per visualizzare il danno al DNA, di osservare il vetrino DNA EtBr macchiato con un microscopio a fluorescenza obiettivo 40X. Valutare danni DNA quantitativamente nelle cellule misurando la lunghezza di migrazione del DNA e la percentuale di DNA migrato (Figura 1A). Quantificare il danno al DNA (Figura 1B) dal momento in cui parti apribili e Olive-Moment. Definizioni di Tail-Moment e Olive -Moment sono stati precedentemente data 8-10. NOTA: Nella nostra esperienza è abbastanza per attaccare da uno dei parametri. Le cellule sono fotografati impostando lo strumento automatico che analizza sulle celle vetrino da microscopio e fotografie. Quantificazione delle rotture del DNA può essere effettuata da pacchetti software di analisi delle immagini. Ci sono diversi pacchetti software differenti che sono realizzati su misura per catturare l'immagine delle cellule e quantificare il danno al DNA. Si consiglia di utilizzare lo stesso pacchetto software tutto l'esperimento. Il tecnico di laboratorio identifica la cellula intatta o una cometa da valutare sul computer e fa clic con il mouse su di esso. La cella cometa o intatto viene segnato automaticamente.