प्रणालीगत oxidative तनाव का एक अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में धूमकेतु परख
Summary
धूमकेतु परख विभिन्न कारकों से प्रेरित डीएनए टूट जाता है, उपाय। डीएनए की क्षति के कारण (oxidative तनाव को छोड़कर) सभी कारकों को स्थिर रखा जाता है, तो डीएनए की क्षति की राशि ऑक्सीडेटिव तनाव का एक अच्छा अप्रत्यक्ष पैरामीटर है। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य oxidative तनाव के अप्रत्यक्ष माप के लिए धूमकेतु परख का उपयोग है।
Abstract
ऑक्सीजन के बिना नहीं रह सकते हायर यूकेरियोटिक जीवों; अभी तक, विडंबना यह है कि ऑक्सीजन उन के लिए हानिकारक हो सकता है। यह अलग पीआई * एंटी संबंध कक्षाओं में स्थित दो अयुगल इलेक्ट्रान है क्योंकि ऑक्सीजन अणु रासायनिक अपेक्षाकृत निष्क्रिय है। इन दो इलेक्ट्रॉनों वे अपने स्वयं के कुल्हाड़ियों के बारे में एक ही दिशा में बारी बारी से है, जिसका अर्थ समानांतर है spins है। ऑक्सीजन के अणु नहीं बहुत प्रतिक्रियाशील है यही कारण है। ऑक्सीजन के एक्टिवेशन दो अलग तंत्र द्वारा हो सकता है; या तो एक समय (monovalent कमी) पर एक इलेक्ट्रॉन के माध्यम से कमी के माध्यम से, या पर्याप्त ऊर्जा के अवशोषण के माध्यम से अयुगल इलेक्ट्रान से एक की स्पिन रिवर्स करने के लिए। इस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेटिव प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन में यह परिणाम है। मानव शरीर के लिए अपनी शारीरिक स्थिति में आरओएस समाप्त जिसमें तरीके के एक नंबर रहे हैं। आरओएस उत्पादन की मरम्मत की क्षमता, oxidative तनाव के परिणाम और नुकसान अलग अणुओं से अधिक है। Oxidative तनाव मुझे हो सकता है जिसके द्वारा कई अलग अलग तरीके हैंasured। इस पांडुलिपि भी डीएनए टूट की माप की अनुमति देता है जो "धूमकेतु परख 'के रूप में जाना जाता सेल जेल वैद्युतकणसंचलन, नाम तरीकों में से एक पर केंद्रित है। Oxidative तनाव के अलावा अन्य डीएनए की क्षति, कारण ज्ञात सभी कारकों को स्थिर रखा जाता है, तो धूमकेतु परख द्वारा मापा डीएनए की क्षति की राशि ऑक्सीडेटिव तनाव का एक अच्छा पैरामीटर है। सिद्धांत सरल है और डीएनए अणु नकारात्मक आरोप लगाया जाता है कि इस तथ्य पर निर्भर करता है। एक अक्षुण्ण डीएनए अणु यह वैद्युतकणसंचलन दौरान विस्थापित नहीं है कि इस तरह के एक बड़े आकार की है। डीएनए टूट जाता है, हालांकि, एनोड की दिशा में बिजली के क्षेत्र में कदम जो छोटे टुकड़ों में मौजूद परिणाम है। छोटे टुकड़ों में तेजी से पलायन। टुकड़े अलग अलग आकार है के रूप में वैद्युतकणसंचलन के अंतिम परिणाम एक स्पष्ट रेखा बल्कि एक धूमकेतु के आकार के साथ एक निरंतरता नहीं है। प्रणाली सेल में डीएनए टूट की जिसके परिणामस्वरूप "धूमकेतु" और इस तरह के एक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।
Introduction
धूमकेतु परख पहले स्वीडन के वैज्ञानिकों Ostling और Johanson 1 द्वारा विकसित किया गया था। डीएनए एक नकारात्मक आरोप लगाया अणु है। वैद्युतकणसंचलन के दौरान, छोटे, क्षतिग्रस्त डीएनए टुकड़े तेजी से एक सकारात्मक आरोप लगाया एनोड 2 की ओर यात्रा करते हैं। डीएनए टुकड़े छोटे, एनोड की ओर तेजी से उनके प्रवास बरकरार, undamaged डीएनए और क्षतिग्रस्त डीएनए टुकड़े 3 से बना एक "पूंछ" की रचना "सिर" के साथ एक ठेठ "धूमकेतु" के रूप में। क्षतिग्रस्त डीएनए 5 काफी संतुलित डीएनए टूट की पीढ़ी जो रखने के शरीर 4 में विभिन्न कार्यप्रणालियों के द्वारा ठीक किया जा सकता। , तथापि, शेष डीएनए टूट के पक्ष में हैं, तो टूटता जमा कर सकते हैं और अंत में एक रोग के विकास के लिए योगदान देगा।
हमारे डीएनए एक निश्चित समय 6 बजे लगभग 0.000165% क्षति ग्रस्त है। एकल असहाय डीएनए टूट डीएनए डबल हेलिक्स की दो किस्में में से एक पर एक दोष करने के लिए देखेंडीएनए डबल हेलिक्स के दोनों किस्में क्षतिग्रस्त हो रहे हैं जब डबल असहाय डीएनए टूट वजह से हैं, जबकि। इस तरह के सेल की उम्र, सिगरेट का धुआँ, विभिन्न दवाओं या oxidative तनाव 7-9 के रूप में एक निश्चित समय पर डीएनए टूट की राशि में वृद्धि हो सकती है, जो विभिन्न कारक हैं। बढ़ाया डीएनए को तोड़ता के लिए अग्रणी सभी कारकों को स्थिर रखा जाता है, तो धूमकेतु परख के माध्यम से डीएनए टूट की मात्रा का ठहराव ऑक्सीडेटिव तनाव का एक अच्छा अप्रत्यक्ष पैरामीटर है।
धूमकेतु परख की विधि नेत्र विज्ञान सहित चिकित्सा में तेजी से आज प्रयोग किया जाता है। इसका एक कारण यह oxidative तनाव और अधिक से अधिक एक विधि परोक्ष रूप से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो oxidative तनाव के साथ है विभिन्न रोगों 8-11 और धूमकेतु परख के लिए एक विकारी तंत्र के रूप में मान्यता प्राप्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्वीडन के वैज्ञानिकों Ostling और Johanson कोशिकाओं 1 में डीएनए की क्षति यों के लिए धूमकेतु परख का उपयोग करने के लिए अपने क्षेत्र में पहले थे। तटस्थ शर्तों दो वैज्ञानिकों का इस्तेमाल किया है, तथापि, केवल डबल असहाय डीएनए टूट जाता है का पता लगाने के लिए अनुमति दी। सिंह एट अल। बाद में डबल और एकल असहाय डीएनए टूट आकलन और क्षार अस्थिर साइटों 12 का पता लगा सकता है कि एक संवेदनशील संस्करण का उत्पादन किया जो क्षारीय परिस्थितियों में उपयोग के लिए परख, रूपांतरित किया। अपनी प्रारंभिक विकास के बाद से, परख विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 13-15 में डीएनए की क्षति के प्रकार का आकलन करने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए विभिन्न चरणों में संशोधित किया गया है।
सभी तकनीकों के साथ के रूप में, तकनीकी जानकारी के लिए कठोर ध्यान दे सटीक परिणाम 16 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव के आधार पर, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं अगर हर पद्धति कदम-से-मात्रा का ठहराव है विशेषज्ञ प्रयोगशाला techn के द्वारा धूमकेतु का प्रदर्शन करने के लिए समाधान की तैयारीicians। ताजा और सही ढंग से तैयार मीडिया, पर्याप्त pipetting तकनीक, सही समय और हौसले से तैयार leukocytes की (पहले परिणाम अनुभाग में उल्लेख है) उपयोग के उपयोग के सटीक परिणाम 17 प्राप्त करने के लिए सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए आदेश में जरूरी है।
इस परख के सभी अलग अलग चरणों विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण हैं। सामान्य सबसे अच्छा परिणाम में 16 प्राप्त कर रहे हैं धूमकेतु मात्रा का ठहराव तक समाधान तैयार करने से हर एक पद्धति कदम विशेषज्ञ प्रयोगशाला technicians.Important द्वारा किया जाता है यदि लगते ताजा और सही ढंग से तैयार मीडिया के उपयोग पर्याप्त pipetting तकनीक, सही समय और के रूप में पहले से ही परिणाम अनुभाग परख 17 से पर्याप्त परिणाम प्राप्त करने के लिए सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए हौसले से तैयार leukocytes के प्रयोग में करने के लिए भेजा।
अन्य तरीके में करते हैं, धूमकेतु परख तकनीक अपने लाभ हैtages और कमियां। एक संवेदनशील तरीका होने के नाते, परख डीएनए टूट बढ़ाने और इस तरह के परिणाम को प्रभावित कर सकता है जो कारकों (जैसे, यूवी प्रकाश) की चपेट में है। शोध किया जा रहा है जो, सिवाय इसके कि oxidative तनाव बढ़ाने सकता है किसी भी कारक है, बचा जाना चाहिए। तनाव ऑक्सीडेटिव तनाव ल्यूकोसाइट्स में बल्कि अन्य सभी रक्त माध्यमों और लिम्फोसाइटों में न केवल के स्तर को बढ़ा सकते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख ऑक्सीडेटिव तनाव 18,19 मापने के कई अलग और अधिक प्रत्यक्ष तरीके हैं। धूमकेतु परख कुछ फायदे हैं, जो कई तरीकों में से एक है। ये उसके रिश्तेदार कम लागत, (<10,000 कोशिकाओं) आवश्यक कोशिकाओं के छोटे संख्या और रोगी के प्रति आवश्यक खून की इस प्रकार छोटे नमूने, कोशिकाओं (लगभग 3 दिन) में डीएनए की क्षति यों के लिए आवश्यक समय के रिश्तेदार छोटी अवधि, इसकी संवेदनशीलता शामिल और अलग अलग सेल-प्रकार में गधे डीएनए की क्षति के लिए अपनी व्यापक प्रसार प्रयोज्यता। हम इस के साथ अनुभव था, क्योंकि अतीत में हम ल्यूकोसाइट्स के साथ काम करने का चयनसेल प्रकार और यह योजना बनाई विशेष रूप से अध्ययन के लिए लागू किया गया था। धूमकेतु परख का एक अन्य लाभ यह है कि विभिन्न प्रकार के और डीएनए की क्षति के स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह इस तरह के डीएनए की मरम्मत का अध्ययन, पूरकता परीक्षण या genotoxicity अध्ययन के रूप में oxidative तनाव के अलावा पढ़ाई के विभिन्न अन्य क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है।
ऑक्सीडेटिव तनाव अब कई बीमारियों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है के रूप में मान्यता प्राप्त है। धूमकेतु परख विधि, oxidative तनाव 18,19 मापने के कई तरीकों में से एक है, जबकि अपेक्षाकृत सरल, बहुमुखी और सस्ती है। महारत हासिल करते हैं, तो इस विधि ऑक्सीडेटिव तनाव भूमिका 8-10,20,21 निभाता है, जिसमें दवा के सभी क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आर्थिक रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव पर हमारे शोध का समर्थन करने के लिए, Triesen लिकटेंस्टीन में, LHW Stiftung को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol – Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |
Referências
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