Comet assay meet DNA-breuken, veroorzaakt door verschillende factoren. Als alle elementen (behalve oxidatieve stress) veroorzaakt DNA beschadiging constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade een goede indirecte parameter van oxidatieve stress. Het doel van dit protocol is het comet assay gebruikt voor indirecte meting van oxidatieve stress.
Hogere eukaryotische organismen kan niet leven zonder zuurstof; nog, paradoxaal genoeg, zuurstof kan schadelijk zijn voor hen. De zuurstof molecuul chemisch relatief inert omdat het twee ongepaarde elektronen in verschillende pi * anti-bonding orbitalen. Deze twee elektronen parallelle spins, wat betekent dat ze roteren in dezelfde richting rond hun eigen as. Daarom zuurstof molecuul niet erg reactief. Activering van zuurstof kan plaatsvinden door twee verschillende mechanismen; hetzij door reductie via één elektron per keer (monovalent reductie), of door absorptie van voldoende energie om de rotatie van één van de ongepaarde elektronen te keren. Dit resulteert in de productie van reactieve oxidatieve deeltjes (ROS). Er zijn een aantal manieren waarop het menselijk lichaam elimineert ROS in de fysiologische toestand. Als ROS productie overschrijdt de reparatie capaciteit, oxidatieve stress resultaten en schade verschillende moleculen. Er zijn veel verschillende manieren waarop oxidatieve stress me kanasured. Dit manuscript is gericht op een van de genoemde cel gelelektroforese, ook bekend als "comet assay" de metingen van DNA breuken toelaat werkwijzen. Als alle factoren waarvan bekend is DNA schade, anders dan oxidatieve stress constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade, gemeten door comet assay is een goede parameter van oxidatieve stress. Het principe is eenvoudig en berust op het feit dat DNA-moleculen negatief geladen. Een intact DNA-molecuul zodanig vergroot dat het niet migreert tijdens elektroforese. DNA breuken, echter indien aanwezig resulteren in kleinere fragmenten die bewegen in het elektrische veld naar de anode. Kleinere fragmenten migreren sneller. Aangezien de fragmenten verschillende grootten het uiteindelijke resultaat van de elektroforese is geen afzonderlijk lijn maar een continuüm met de vorm van een komeet. Het systeem maakt een kwantificering van de resulterende "comet" en dus van de DNA breuken in de cel.
Comet assay werd voor het eerst ontwikkeld door Zweedse wetenschappers Ostling en Johanson 1. DNA is een negatief geladen molecuul. Tijdens electroforese, kleinere, beschadigde DNA-fragmenten sneller reizen naar een positief geladen anode 2. De kleinere DNA-fragmenten, hoe sneller de migratie naar de anode tot een typische "comet" met een "head" bestaande uit intacte, onbeschadigde DNA en een "staart" bestaande uit beschadigde DNA-fragmenten 3 vormen. Beschadigd DNA kan worden hersteld door verschillende mechanismen in het lichaam 4, waarbij het genereren houden van DNA breuken vrij evenwichtig 5. Indien echter de weegschaal in het voordeel van DNA breuken, kunnen de onderbrekingen ophopen en uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van een ziekte.
Ons DNA lijdt ongeveer 0.000165% schade op een gegeven moment 6. Enkelstrengs DNA breuken betrekking op een defect aan een van de twee strengen van de DNA dubbele helixdat dubbelstrengs DNA breuken veroorzaakt wanneer beide strengen van de DNA dubbele helix beschadigd. Er zijn verschillende factoren die de hoeveelheid DNA breuken op een bepaald moment kan versterken, zoals de leeftijd van de cel, sigarettenrook, verschillende drugs of oxidatieve stress 9/7. Als alle factoren die leiden tot betere DNA-breuken constant worden gehouden, dan is de kwantificering van DNA breuken via comet assay is een goede indirecte parameter van oxidatieve stress.
De methode van de komeet assay wordt steeds meer gebruikt vandaag de dag in de geneeskunde, waaronder de oogheelkunde. Een reden hiervoor is dat oxidatieve stress steeds meer erkend als pathogenese van verschillende ziekten 8-11 en comet assay is een methode waarbij oxidatieve stress indirect kunnen worden gekwantificeerd.
Zweedse wetenschappers Ostling en Johanson waren de eerste in hun vakgebied te komeettest gebruiken om DNA-schade in de cellen 1 kwantificeren. De neutrale omstandigheden dat de twee wetenschappers die echter alleen kon de detectie van dubbelstrengs DNA breuken. Singh et al. Ingericht later de assay voor gebruik onder alkalische omstandigheden, die een gevoelige versie die dubbel en enkelstrengs DNA breuken kunnen beoordelen en detecteren alkali-labiele plaatsen 12 geproduceerd. Sinds de eerste ontwikkeling is de assay aangepast in verschillende stappen het geschikt voor het beoordelen typen DNA schade in verschillende celtypes 13-15 te maken.
Zoals bij alle technieken, waarbij strikte aandacht voor technische details belangrijk om nauwkeurige resultaten te 16 verkrijgen. Op basis van onze ervaring, worden de beste resultaten verkregen als elke methodologische stap uit de oplossing voorbereiding tot komeet-kwantificering wordt uitgevoerd door deskundige laboratorium technicians. Het gebruik van verse en juist bereide media, adequate pipetteertechnieken, exacte timing en (zoals eerder in de paragraaf resultaten vermeld) het gebruik van vers bereide leukocyten zijn essentieel om lysis en gelelektroforese om nauwkeurige resultaten te 17 verkrijgen.
Alle afzonderlijke stappen in deze assay zijn even belangrijk voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. 16 Over het algemeen de beste resultaten worden verkregen wanneer elke methodologische stappen van oplossingspreparaat tot comet kwantificering wordt uitgevoerd door ervaren laboratorium technicians.Important lijken het gebruik van verse en juist bereide media voldoende pipetteertechnieken, exacte timing en zoals reeds in de resultaten sectie het gebruik van vers bereide leukocyten voor lysis en gelelektroforese om voldoende resultaten te verkrijgen van het 17 genoemde assay.
Als andere methodes, de komeet assay techniek heeft zijn advanTages en nadelen. Als een gevoelige werkwijze is de test gevoelig voor factoren (bijvoorbeeld, UV-belichting) die DNA breuken kunnen vergroten, zodat de resultaten beïnvloeden. Elke factor die oxidatieve stress kunnen versterken, met uitzondering dat wordt onderzocht, moet worden vermeden. Stressoren kunnen niveau van oxidatieve stress niet alleen in leukocyten, maar ook in alle andere bloed mediums en lymfocyten te verhogen. Zoals eerder vermeld zijn er veel verschillende en directere manier meten oxidatieve stress 18,19. De comet assay is een van vele werkwijzen die bepaalde voordelen heeft. Deze omvatten een relatief lage kostprijs, het kleine aantal cellen vereist (<10.000 cellen) en daarmee de kleine bloedmonsters vereist per patiënt, de relatieve korte periode nodig is om DNA schade in cellen (ongeveer 3 dagen) kwantificeren de gevoeligheid en de wijdverbreide toepassing op ezels DNA schade in verschillende celtypen. In het verleden kiezen we ervoor om te werken met leukocyten omdat we ervaring met dezeceltype en toepassing was voor specifieke studie gepland. Een ander voordeel van het comet assay is dat het kan worden gebruikt om verschillende typen en niveaus van DNA schade detecteert en daardoor kan in diverse andere gebieden van studies naast oxidatieve stress zoals DNA herstel studies, aanvulling proeven of genotoxiciteit worden toegepast.
Oxidatieve stress is nu erkend als een centrale rol spelen in de pathogenese van verschillende ziektes. De comet assay werkwijze, terwijl een van vele manieren voor het meten van oxidatieve stress 18,19, relatief eenvoudig, veelzijdig en goedkoop. Wanneer de knie, kan deze methode worden gebruikt in alle gebieden van de geneeskunde, waarin oxidatieve stress speelt rol 8-10,20,21.
The authors have nothing to disclose.
We zouden graag de LGA Stiftung bedanken, in Triesen Liechtenstein, voor financiële ondersteuning van ons onderzoek naar oxidatieve stress.
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |