Comet assay som et indirekte mål for Systemisk oxidativt stress

Undersøgelser af komet assay udført på University of Basel, blev Institut for Oftalmologi godkendt af den lokale etiske udvalg af Basel 1. Fremstilling af reagenser Forbered Dulbeccos phosphatbufret saltvand (PBS) (Ca ++, Mg ++ fri) opløsning ved tilsætning af PBS (1 I pakke) og 990 ml dH2O til medierne. Justere pH til 7,4. Opbevares ved stuetemperatur. Forberede lyserende opløsning: Til fremstilling 1.000 ml tilsættes 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) og 10 mM Trizma base (1,2 g) i dH 2 O. Forbered elektroforese buffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) ved tilsætning af 30 ml 10 M NaOH og 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs til 1500 ml dH2O og bland godt. Det totale volumen afhænger gelboksen kapacitet. Inden anvendelse måle pH i bufferen for at sikre en pH-værdi på> 13. Forbered neutralisering puffer indeholdende 0,4 M Tris (48,5 g sat til ~ 800 ml dH2O, justere pH til 7,5), koncentreret (& #62; 10 M HCI) i 1000 ml med dH 2 O. Opløsningen opbevares ved stuetemperatur. Forbered farvningsopløsning. Til Ethidiumbromid (EtBr, 10x Stock, 20 pg / ml) tilsættes 10 mg EtBr i 50 ml dH2O og opbevares ved stuetemperatur. For 1x Lager – bland 1 ml med 9 ml dH 2 O. Forsigtig! Håndtag EtBr med tilstrækkelig forsigtighed, da det er et kendt carcinogen. 2. Isolering af leukocytter Opnå blodprøver humane (20 ml) med antikoagulerende såsom heparin med venøse punktur. Adskille lymfocytter ved anvendelse af en densitetsgradient celleseparator såsom Histopaque. Kort beskrevet fortyndes blod i forholdet 1: 1 med PBS eller RPMI (uden FBS) og lag over 600 pi celleseparator væske. Centrifuger 1.800 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Aspireres »buffy" coat i 3-5 ml PBS / RPMI og centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter til pelletering lymfocytterne. Hent lymfocytter fra lige over grænsen mellem PBS (RPMI) Og celleseparator væske ved hjælp af en pipette. Fjern leukocyt bands fra grænsefladen mellem plasma og celleseparatoren flydende lag af hvert rør og anbring i en 50 ml rør. Bring det samlede volumen til 50 ml med kold Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM). Vask cellesuspensionen tre gange med DMEM ved 300 xg i 10 min. Tælle det samlede antal celler ved anvendelse af et hæmocytometer. Suspendere cellerne i PBS og aliquote i mikrocentrifugerør ved 10 7 celler / rør. Pipetter 0,4 ml af celler i en 5 ml plast engangs rør. Tilsæt 1,2 ml 1% lav-geldannende temperatur agarose ved 40 ° C. Bland og hurtigt og pipetteres 1,2 ml cellesuspension på agarose-dækkede overflade af et præ-coated objektglas. Undgå at producere bobler. Tillad agarose til gel i ca. 2 min. Være i overensstemmelse med den tid og temperatur, der anvendes til gelering, og sikre, at agarose er helt indstillet, før nedsænkning i lyseopløsning. Efter fuldt set, dykke ind lyseringsopløsning på ~ 4 ºC. 3. Lysis og elektroforese BEMÆRK: Den beskrevne procedure er for elektroforese under pH> 13 alkaliske betingelser. Efter mindst 2 timer ved ~ 4 ºC, fjerne forsigtigt glider fra lyseringsopløsning. Sted slides side om side på den vandrette gelboksen nær den ene ende, skyde dem så tæt sammen som muligt. Fyld buffer reservoirer med frisklavet pH> 13 elektroforese buffer indtil væskeniveauet fuldstændig dækker dias (undgå bobler over agarose). Lad objektglas sidde i alkalisk buffer i 20 min for at tillade afvikling af DNA og ekspression af alkali-labil skader. Tænd strømforsyningen til 25 volt (~ 0,75 V / cm) og justere den nuværende til 300 milliampere ved at hæve eller sænke buffer niveau. Elektroforese objektglassene i 30 minutter. Sluk for strømmen. Løft forsigtigt dias fra bufferen og pblonder på et dræn bakke. Dråbevis coate objektglassene med neutralisering Buffer. Tillad objektglassene til at sidde i mindst 5 min. Drain objektglas og gentag to gange mere. Farv dias med 80 pi 1x ethidiumbromid (EtBr) og henstår i 5 min, og derefter dyppe i afkølet destilleret vand for at fjerne overskydende pletten. Derefter placere et dækglas over dias og gemme dem med det samme. Store glider i en måned ved stuetemperatur under tørre forhold. BEMÆRK: Andre DNA pletter (f.eks SYBR-grønt), kan også anvendes. Forsigtig! bære beskyttelseshandsker, da de fleste farvestoffer er mutagene. 4. Kvantificering af DNA-brud At visualisere DNA-skader, observere EtBr-farvede DNA dias under en 40X objektiv fluorescerende mikroskop. Vurdere DNA-skader kvantitativt i cellerne ved at måle længden af DNA migration og procentdelen af migrerede DNA (figur 1A). Kvantificere DNA-skader (figur 1B) ved bag- øjeblik og Olive-moment. Definitioner af Tail-Moment og Olive -Moment har tidligere fået 8-10. BEMÆRK: Det er vores erfaring, det er nok til at holde fast ved en af ​​parametrene. Cellerne fotograferet ved at indstille automatiseret værktøj, der scanner over mikroskop slide og fotografier celler. Kvantificering af DNA-brud kan gøres ved billedanalyse softwarepakker. Der er flere forskellige software pakker, der er skræddersyet til at tage billedet af cellerne og kvantificere DNA-skader. Vi anbefaler at bruge den samme software-pakke hele eksperimentet. Den laborant identificerer den intakte celle eller komet at blive scoret på computeren og klikker med musen på det. Den komet eller intakt celle er derefter automatisk scoret.