在巴塞尔大学进行的研究彗星试验，眼科批准了巴塞尔当地的伦理委员会 1.准备试剂制备的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）中（中Ca2 +，Mg ++的）加入PBS（1L包）和990毫升卫生署2 O至媒体溶液。将pH调节至7.4。存储在室温。 制备溶胞溶液：制备千毫升在卫生署2 O.加入2.5 M氯化钠（146.1克），100毫摩尔EDTA（37.2克）和10mM Trizma碱（1.2克） 准备电泳缓冲液（300毫米氢氧化钠/ 1毫摩尔EDTA）加入30毫升10 M氢氧化钠和7.5毫升0.2M EDTA，QS到1500毫升卫生署2 O和拌匀。的总体积取决于该凝胶盒的容量。在使用之前，测量所述缓冲液的pH，以确保pH为> 13。 制备含0.4米的Tris缓冲液中和（48.5克加入到〜800毫升卫生署2 O，调节pH值至7.5），浓（＆＃62; 10 M盐酸）1000毫升卫生署2 O.存储溶液在RT。 准备染色溶液。以溴化乙锭（EtBr的10×股票，20微克/毫升）加入10毫克的EtBr的在50毫升的dh 2 O和存储在RT。对于1X股票-将1毫升9毫升卫生署2 O.谨慎！处理溴化乙锭有足够的预防措施，因为它是一种已知的致癌物质。 2.分离白细胞使用静脉穿刺获得的人类血液样品（20ml）中与抗凝血剂，如肝素。 分开使用密度梯度细胞分离的淋巴细胞如的Histopaque。 简言之，将稀释血液在1：1的比例用PBS或RPMI（无FBS）和层600微升细胞分离器的液体。 离心机1800 XG为20分钟，在4℃。吸出“血沉棕黄'外衣成3-5毫升的PBS / RPMI中，并在300×g离心离心10分钟以沉淀淋巴细胞。 从正上方PBS之间的边界检索淋巴细胞（RPMI）和细胞分离器的液体，使用移液器。从血浆和各管的细胞分离液层之间的界面除去白细胞频带，并收集到一个50ml管中。 使总体积至50ml用冷Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）。在300×g离心洗细胞悬液三次用DMEM 10分钟。 计数的总数目使用血球细胞。悬浮细胞在PBS中，小份到微量离心管中以10 7个细胞/管。 吸管0.4毫升细胞到一个5毫升的塑料一次性管。加1.2毫升1％低胶凝温度琼脂糖在40℃。混合，并迅速与吸管1.2毫升细胞悬液到预涂覆载片的琼脂糖覆盖表面。避免产生气泡。 允许琼脂糖凝胶进行约2分钟。是与用于胶凝的时间和温度保持一致，并确保琼脂糖浸没在裂解溶液之前完全建立。经过充分s等，淹没成裂解液在4〜ºC。 3.裂解和电泳注意：所述的程序是用于pH> 13的碱性条件下电泳。 后至少2小时，在〜4ºC，轻轻地从裂解溶液除去幻灯片。广场上滑动靠近一端的水平凝胶箱并排，滑动他们为接近越好。 填充缓冲区水库和新鲜的pH值> 13电泳缓冲液，直到液面完全覆盖的幻灯片（避免气泡在琼脂糖）。 让载玻片坐在碱性缓冲液中20分钟，以允许该DNA的退绕和碱不稳定的损伤中的表达。 打开电源到25伏（〜0.75伏/厘米），并调整到300毫安的电流通过提高或降低的缓冲水平。 Electrophorese幻灯片30分钟。 关闭电源。轻轻抬起幻灯片从缓冲区和p蕾丝漏托盘。滴加大衣和缓冲液的幻灯片。允许的幻灯片坐至少5分钟。漏的幻灯片，并重复两次以上。 染色用80微升1×溴化乙锭（EtBr的）的幻灯片和离开5分钟，然后浸在冷冻蒸馏水以除去过量染色剂。然后将盖玻片在幻灯片，并立即保存。商店幻灯片一个月在室温在干燥条件下。 注意：其他DNA污渍（ 例如 ，SYBR绿）也可以使用。注意！戴防护手套，因为大多数染料是致突变。 4.定量DNA断裂以可视化的DNA损伤，观察一个40X的目标荧光显微镜下溴化乙锭染色DNA的幻灯片。 通过测定DNA的迁移的长度和迁移的DNA（ 图1A）的百分比在细胞中定量评估的DNA损伤。定量DNA损伤（ 图1B）由Tail-时刻，橄榄MOMENT。尾矩，Olive -Moment定义先前已给予8-10。 注：根据我们的经验是不够的参数之一坚持。这些细胞通过设置自动化的工具，通过扫描显微镜载玻片和照片拍摄的细胞。 DNA断裂的定量可以通过图像分析软件包来完成。但是也有一些定制捕捉细胞的图像和量化的DNA损伤的几个不同的软件包。我们建议使用整个实验相同的软件包。化验员标识要打进电脑上的完整细胞或彗星，并用鼠标点击就可以了。彗星或完整的细胞，然后自动计分。