O peixe-zebra é um bem estabelecido modelo de organismo vertebrado para estudar muitos aspectos do desenvolvimento, a fisiologia, a doença, e regeneração. Com a crescente adopção de peixe-zebra como um modelo para os processos biológicos de pós-embrionárias, ferramentas experimentais para, manipulação específica de tecido da expressão génica indutível ou vias de sinalização tornaram-se cada vez mais importante. Particularmente, os estudos sobre a regeneração de órgãos e apêndice no peixe-zebra adulto têm sofrido com a falta de ferramentas para dissecar os requisitos espaço-temporais de vias de sinalização durante estes processos regenerativos.

Actualmente, três sistemas diferentes têm sido usados ​​para alcançar, expressão condicional específica de tecido do gene na regeneração de órgãos de peixe-zebra adulto: o sistema Cre-lox, expressão de mosaico de choque térmico utilizando transgenes indutíveis transposão transgénese mediada por somática, e o sistema de ¹ téton ^-3. Téton refere-se a uma variante de uma tetraciclina-contsistema de activação transcricional laminadas, onde a expressão é activada na presença do antibiótico tetraciclina ou um seu derivado, por exemplo, doxiciclina. O sistema Cre-lox, uma vez que até agora tem sido usado em peixes adultos, depende de uma recombinase Cre controlado-Tamoxifeno (CreERT2), cuja expressão é limitada espacialmente por elementos reguladores específicos de tecido. Remoção Cre-impulsionado de uma cassete de PARAGEM facilita a expressão do gene de interesse accionado por um promotor que deve ser activo em todos os tipos de células ^1. Mediada por transposão criação de transgenes somáticas mosaically expressas fornece um sistema para a expressão induzível do transgene em linhagens celulares individuais. A injecção de embriões de peixes-zebra com um transposão Tol2 portador de um gene de interesse sob o controlo transcricional de um promotor de choque térmico resultados em indivíduos quiméricos tipicamente transportam o transgene apenas em linhagens celulares distintas de um órgão de regeneração ^2. Embora ambos os sistemas permitem condicional tecido-spea expressão do gene espe-, o sistema Cre-lox não é reversível, e usando a estratégia de rotulagem clonal à base de transposão sofre com a sua natureza estocástica. Assim, nós e outros recentemente adaptado sistemas Teton transgênicos para uso em peixes-zebra, que facilitam temporal e expressão de genes controlados por espacialmente que é sintonizável em adição e reversível ^3-5.

O sistema utilizado aqui téton compreende um controlador de linha transgénica (TetActivator) em que um de doxiciclina (DOX) -inducible activador transcricional (melhoria transactivador tetraciclina reversa, irtTA, curto TETA) está sob o controle de sequências reguladoras genómicos específicos de tecidos. Em segundo lugar, requer uma linha transgénica respondedor (TetResponder) que abriga um gene de interesse sob o controlo transcricional do operador de tetraciclina (Tet elemento de resposta; tetre) (Figura 1A). Assim, a utilização de combinações específicas de TetActivator e TetResponder linhas permite condicional tecido-específic manipulação da expressão do gene.

Temos recentemente utilizou o sistema de Teton para sondar para funções específicas de tecidos de sinalização Wnt / beta-catenina no adulto regeneração da cauda do peixe-zebra fin ^3. No protocolo descrito aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para set-up e uso do sistema de Teton no peixe-zebra, em particular para estudos de regeneração fin. Isso inclui instruções detalhadas sobre como gerar TetActivator e TetResponder linhagens transgênicas estáveis ​​e um protocolo de indução transgene em embriões de peixe-zebra e adulto. Além disso, descreve-se técnicas para a verificação da expressão do gene específica para um tecido regenerado em barbatana, incluindo um protocolo para a preparação de criocortes de aletas de peixe-zebra adultos. Além disso, nós discutimos considerações para a concepção do transgene TetActivator, a escolha de um método de transgénese, e detecção da expressão TetResponder. Assim, o objetivo geral deste protocolo é para servir como um modelopara o estabelecimento de um sistema de téton funcional em peixes-zebra para conseguir a expressão do gene específica para um tecido condicional, o qual pode ser aplicado a qualquer tecido de interesse.

Nós criamos um vetor TetActivator permitindo I-SCEI ou geração Tol2 mediada de linhas TetActivator estáveis ​​utilizando sequências de regulação genômicas curtas (fragmentos potenciador; banco de dados plasmídeo laboratório Weidinger nenhum 1247;. Figura 1B). Esta construção contém uma cassete que consiste TetActivator da variante mutante M2 do domínio inversa repressor Tet fundido com o vírus Herpes simplex VP16-domínio de transactivação derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressão do TetActivator (TETA) pode ser facilmente monitorizada uma vez que é co-expressa com a AmCyan fluoróforo a partir do mesmo enquadramento de leitura aberto; um péptido P2A medeia salto ribossomal, o qual deve resultar na produção de TETA e AmCyan como proteínas separadas a uma razão 1: 1 ^5,6. O construto também contém um poylinker 5 'do tetActivator cassete para facilitar a inserção de sequências genómicas reguladoras de interesse utilizando métodos de clonagem convencionais.

Além disso, criámos um constructo consistindo do acima descrito cassete TetActivator além de uma cassete de selecção com canamicina (base de dados não plasmídeo laboratório Weidinger 1180;. A Figura 1C), o qual pode ser recombinado num cromossoma bacteriano artificial (BAC) contendo uma grande região genómica ( geralmente no codão de iniciação de um gene cuja expressão padrão é para ser mimetizado pelo transgene). Ambas as construções são disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido.