マウスナイーブCD4⁺ T細胞の単離と<em>インビトロ</em> T細胞サブセットへの分化

CD4 ⁺ Tヘルパー（Th）細胞の明確な系統またはサブセットの概念は、20 ^世紀1の後半から出回っている。細胞増殖と細胞のThエフェクターへの最終的な分化のいくつかのラウンドで共刺激シグナルの結果の存在下で同族抗原の認識。このプロセスの間に生成されたTh細胞のタイプは、活性化²中に存在するサイトカイン環境に依存する。最初に、ナイーブTh細胞は、T細胞受容体（TCR）活性化、共刺激CD28のライゲーション、およびサイトカインシグナル伝達以下、2つの異なる系統に分極すると考えられていた。 1型ヘルパー細胞（Th1が）IFNγサイトカインのそのエフェクター生産ならびに分化プロセス^3,4の間にIL-12シグナル伝達に対するそれらの要件によって特徴付けられる。最終的には、分化したTh1細胞は、ほとんど区別bとを特徴とする遺伝的プロファイルを有することが発見されたYのTh1遺伝的プログラム⁵のマスターレギュレーターと考えられているTボックスファミリー転写因子の発現、Tbx21（T-BET）、。さらに、IL-12と同様にIFNγは、T-bet発現^6,7を促進することができます。免疫応答を、Th1細胞は、細胞内病原体、ならびに自己免疫性炎症の強力なプロモーターに対する宿主防御のために重要である。対照的に、2型ヘルパー細胞（Th2の）は、それらの開発のためのIL-4およびIL-4、IL-5を含むそれらのエフェクターサイトカイン、およびIL-13を必要とし、B細胞応答を駆動するために重要であり、アレルギー⁸において病原性であり^{、 9。} Th1細胞と同様に、Th2細胞は、自分のマスター転写調節因子を発現することが見出された、GATA-3 ^10,11と称される。興味深いことに、偏サイトカインの存在と特定のTh系統の世代は、特定のThサブセットが、免疫再中に優勢になることを示唆している、他人^2,12の発展に拮抗的であるsponse。

Th1とTh2の系統の同定以来、最近（、さらなる作業は濾胞ヘルパー（TFH）、IL-9産生（TH9）を含むヘルパーT細胞のさらに多くのユニークなサブセットを、実証した、およびIL-22を産生する（TH22） ¹³で）検討。 in vitroでの分化実験のために、このプロトコルは2つだけ追加のThサブセットに焦点を当て、調節性T細胞（Treg細胞）およびIL-17産生CD4 ⁺ T細胞（Th17細胞）と呼ばれる。 CD25 ⁺制御性T細胞は胸腺で自然に（nTreg）が発生することがあります。ナイーブTh細胞はまた^、（14,15に総説）周辺の規制になるために（iTreg）を誘導することができる。 Tregの両方のタイプの特性転写因子を発現し、可溶性抗炎症性メディエーター産生、IL-2の消費、および細胞接触依存性の機構^14,15を含み、それらのエフェクター抑制メカニズムにとって重要であるフォークヘッドボックスP3（Foxp3の）は、と呼ばれる。 Foxpの欠如深刻な、多臓器自己免疫疾患の3式の結果は、炎症を解決し、自己抗原¹⁶に末梢寛容の調節におけるこのThのサブセットの重要な役割を実証し、免疫調節異常、内分泌腺、腸、X連鎖症候群（IPEX）と呼ばれる。アップレギュレートするのFoxp3およびIL-2による刺激のTregプログラムにコミットなり^14,15 TGF-βin vitroでのナイーブCD4 ⁺ Tヘルパー細胞。 ^（17,18に総説）はサイトカイン産生を検討する場合は特に、CD4 ⁺ T細胞系統のかなりの可塑性の中等度があってもよい。しかし、in vitroでの分化プロトコルの目的のために、我々は、ユニークな系統として各サブセットを議論する。

最近、IL-17のサイトカインを産生するTh17細胞のサブセットは、自己免疫炎症^19-21の間、特に病原性の炎症促進性機能を有するユニークな系統として同定された。 Th17細胞は、固有の転写因子を発現し、Th17の遺伝的プログラム^22を調整レチノイド関連オーファン受容体γトン（のRORγt）と呼ばれる。 TGFβは、RORγtの誘導を介してのTh17系統の世代のために重要である。しかしながら、TGFβシグナル伝達の効果のみ^（12日）、IL-6と相乗際のTh17コミットメントを誘導すると考えられている。さらなる研究は、他の正IL-1βを含む、Th17細胞のコミットメントを調節することができる信号が増加ナトリウム、およびTLR種々の^23-26をシグナリングすることを示した。他の報告では、 インビボで病原性Th17細胞が実際TGFβシグナル伝達をバイパスするものであり、その代わりに、それらの分化²⁷ IL-1、IL-6、およびIL-23の組み合わせに依存することを示唆している。したがって、Th17細胞は、シグナル伝達経路の様々な由来してもよい。 Th17の系譜コミットメントのためにこのプロトコルの目的のために、一般的に使用される（TGFβおよびIL-6）経路表示されます。

すべてのエフェクター系統のために以下に記載される分化プロトコルは、実験の全過程を通じて、TCRおよびCD28のための刺激として固定した抗体に依存しています。しかし、他の2日間²⁹抗原提示細胞²⁸またはハムスター抗体と架橋抗CD3および抗CD28抗体によるTCR活性化は、様々なThのサブセットの生成を誘導する非常に有効な手段であること。実証されているここに提示されたプロトコルは、Th17細胞^31を二次リンパ器官³⁰から、マウスCD4 ⁺ T細胞を単離および生成するための以前に報告された方法を上に構築する。一つの大きな違いは、このプロトコルは、リンパ組織からのナイーブCD4 ⁺ T細胞を分離するセルソーターの使用に依存することである。しかし、多くの企業が要件fのをバイパスすることができる可能性が、ナイーブCD4 ⁺ T細胞を濃縮することができ迅速な分離キットを提供または実験に応じてソート。このプロトコルで提示方法および試薬は、私たちが日常的に最も効果的に使用すると何を見つけるです。しかし、別の試薬および方法論は、以下に提示手順の多くのために存在し、それが彼らの目的のために最適に動作されるか決定するために、個々の研究室次第であることに留意してください。