We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.
The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.
The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.
Denna metod gör det möjligt att observera sårläkning och vävnadsregenerering i levande zebrafisk larver med in vivo tidsförlopp avbildning på en ljusfältsstereo, med hjälp av en jämförelsevis enkel installation. Denna procedur kräver vissa viktiga aspekter som vi har testat, som optimerar resultatet: 1) Låga agaros koncentrationer (~ 0,5%) kommer att minimera tillväxthinder i ständigt växande larver zebrafisk, 2) Borttagning av agarosen runt fenan är viktigt att inte skymma läkningsprocessen, 3) Svällning agarosen i en plastmask behåller agaros och djur i ett stabilt läge under hela förfarandet, och 4) En riktig temperaturkontrollerad miljö, vilket är viktigt för larv livskraft. Vi har anpassat en uppvärmd inkubationskammare 23,24, som använder bubbelplast som är tejpad på kartong och en trådbunden kupol värmare för att kontrollera temperaturen och ordentlig luftcirkulation med minimala fluktuationer underavbildningsproceduren. Denna enkla och kostnadseffektiva kammare kan framställas för att passa alla mikroskop. En liknande uppvärmd inkubationskammare har också använts för avbildning möss och chick utveckling 24,29.
Vi föreslår att pre-amputerade larver är monterade för en pre-amputation bild, demonterades för amputation, och återmonteras för time-lapse avbildning. Även om det är möjligt att utföra dessa steg i ett enda steg i den slutliga bildkammaren, i vår erfarenhet som vi fann att amputera stjärtfenan på ett täckglas är inte optimalt, eftersom det sliter vävnaden och inte resulterar i ett rent snitt. Agarosen baserade amputation metod med användning av en sprutnål ursprungligen beskrivits av Kawakami och kollegor (2004) 16 och är också, enligt vår erfarenhet, idealisk för att utföra amputationer. Således är det ganska komplicerad serie steg som vi presenterade väl motiverad och säkerställer en optimal regenere utfall.
Vi visade att larval zebrafisk vid 2 dpf kan avbildas upp till 1,5 dagar i agaros och Tricaine lösning. Vi pH-optimerade Tricaine (pH 7) lösning framställd med Instant Ocean salt, vilket inte stör den förlaga hälsa för presenterade bildperioden används. Vi har tidigare dock också visat att användning av Tricaine i Danieau medel tillåter tidsförlopp avbildning av 2,5 dpf larvzebrafisk på en konfokalmikroskop i minst 2 dagar 30. Således kan optimala buffertbetingelser förlänga larv hälsa och längden på avbildning. Alternativt kan lägre Tricaine koncentrationer användas för anestesi, eller 2-fenoxietanol, som vi hittade tolereras väl under larv och vuxenstadier vid 28 ° C under minst 60 timmar.
För att undvika fel i fin förnyelse, vi bort agarosen från stjärtfenan innan avbildning. Våra data visar att inom 1,5 dagar fenan har regener till ca 60%. Denna regenerehastigheten överensstämmer med en tidigare studie som definierar tre dagar is en genomsnittlig tid för stjärtfenan förnyelse i zebrafisk larver upp till 6 dpf 16. Alternativa metoder till agaros skulle emellertid kunna utnyttjas för att montera fisken för avbildning. Till exempel, koagulerar tunn plasma 31 eller fluorerad etylen (FEP) rör belagda med metylcellulosa och fyllda med mycket låga agaros koncentrationer (0,1%) har rekommenderats för ljus plåt mikroskopi 32 och kan vara lämpliga för vår presenterade metoden. Men vi rekommenderar inte metylcellulosa och 0,1% agaros, eftersom de kräver att provet är monterade i botten av kammaren på grund av bristen på solidifiering av dessa medier. Mycket höga halter av metylcellulosa kommer dessutom att generera luftfickor baserat på vår erfarenhet, och dessa kan störa avbildning förfarande. Om dessa medier föredrages med användning av bottenkammaren, är det viktigt att en lämplig arbetsavstånd mellan objektivlinsen och preparatet är närvarande. Det bör noteras att metylcellulosa som ett monteringsmedium rekommenderas endast för upp till 1 dag, eftersom det kan störa larver hälsa 32.
Montering förlagan i locket kan resultera i en långsam gravitationsnedåtglidning. Det rekommenderas därför att avbilda flera sektioner vid varje tidpunkt, som antingen kan projiceras i en enda plan eller bara bilder i fokalplanet kan extraheras för montering av färdiga filmen. Imaging preparatet i botten kammaren skulle kunna vara ett alternativ metod för att undvika potentiell nedåtglidning. Plasmaproppar kan vara användbart för att undvika avdrift, eftersom plasman fastnar på yttre omslutande skikt (EVL, periderm) 31 och därför kan stabilisera preparatet. Detta måste dock testas, samt hur länge larver zebrafisk kan hållas i plasmaproppar utan att störa larver hälsa eller fin förnyelse.
Vår film monterades utnyttjar enskilda avsnitten (26 nm)av en inspelad z-stack, vilket omfattade hela tjockleken på fenan (~ 10 mikrometer) och som stod för potentiell z-drift av fenan under avbildningsförfarandet. För att behålla 3-D-information, är det även möjligt att projicera z-stackar i enstaka bilder. Eftersom detta kan resultera i oskärpa i bilden, kan bright deconvolution önska. Programvara, såsom Deconvolve eller Autoquant X3 skulle kunna utnyttjas för detta ändamål. Alternativt kan matematiska algoritmer (beskrivna i Tadrous 33) appliceras för att erhålla en punkt-spridningsfunktion av högt signal-till-brusförhållande (SNR). Skaffa en hög SNR representerar en av de största hindren i bright deconvolution. Även om denna metod kräver hög kontrast och tunn provtjockleken, skulle det vara lämpligt för avbildning av stjärtfenan på grund av dess reducerade bredd.
En klar fördel med den presenterade avbildningsmetod är att det är snabbt anpassningsbar till alla stereomikroskop utrustat med en CCD-kamera ettd tidsförlopp mjukvara och erbjuder ett prisvärt alternativ till dyrare konfokala bildsystem. Även om denna metod inte utnyttjar fluorescens för celldetektering, kan den förlängas för sådana tillämpningar genom att utnyttja ett automatiserat system för slutarkontroll och efterbild deconvolution programvara 34. Detta skulle göra det möjligt för användare att ytterligare följa sårläkning och regenereringsprocesser med enstaka cell eller subcellulär upplösning över längre tidsperioder.
Den optiska klarhet och lätthet med vilken embryonala och larvzebrafisk kan hanteras, och anpassningsförmåga denna metod till varje stereomikroskop gör den lämplig för undervisning grundläggande ryggradsdjur biologi i ett klassrum. Denna metod kan ge studenterna en bättre förståelse av de grundläggande biologiska processer som ligger bakom vävnad reparation och förnyelse. Andra biologiska processer som har tagits med en liknande metod är zebrafisk embryonal utveckling 23,34 och hjärtfunktion (opublicerad). Denna metod erbjuder också möjligheten för uppföljning sårläkning och regenerering i larver som har blivit genetiskt och farmakologiskt manipuleras.
The authors have nothing to disclose.
We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense – USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.
Reagents | |||
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500) | |||
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100) | |||
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690] | |||
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store) | |||
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140) | |||
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505) | |||
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699) | |||
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008) | |||
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007) | |||
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013) | |||
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher) | |||
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm | |||
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15) | |||
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75) | |||
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15) | |||
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot) | |||
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE | |||
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007) | |||
Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10) | |||
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657) | |||
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653) | |||
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145) | |||
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00) | |||
Equipment | |||
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci) | |||
Zeiss Discovery.V12 compound microscope | |||
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective | |||
Zeiss AxioCam MRm | |||
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) |