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Neurociência

Tintoria Insetti per comportamentali saggi: il comportamento di accoppiamento di anestetizzati<em> Drosophila</em

Published: April 22, 2015
doi:
10.3791/52645
, ,
1Institute of Integrative Biology,University of Liverpool

Summary

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Abstract

Esperimenti di accoppiamento utilizzando Drosophila hanno contribuito notevolmente alla comprensione di selezione e il comportamento sessuale. Esperimenti spesso richiedono metodi semplici, semplici ed economiche per distinguere tra gli individui in un processo. Una tecnica standard per questo è di CO 2 l'anestesia e poi etichettatura o ala clipping ogni mosca. Tuttavia, questo è invasivo e ha dimostrato di influenzare il comportamento. Altre tecniche hanno utilizzato colorazione per identificare mosche. Questo articolo presenta un metodo semplice e non invasivo per l'etichettatura Drosophila che permette loro di essere identificati individualmente entro esperimenti, utilizzando coloranti alimentari. Questo metodo è usato in processi in cui due maschi competono per accoppiarsi con una femmina. Tintura permesso l'identificazione facile e veloce. C'era tuttavia qualche differenza nella forza della colorazione di tutti i tre specie testate. I dati sono presentati mostrando il colorante ha un minore impatto sul comportamento di accoppiamento di CO 2 de Drosophila melanoGaster. L'impatto di anestesia CO 2 è indicata a dipendere dalla specie di Drosophila, con D. pseudoobscura e D. subobscura mostrando alcun impatto, mentre D. maschi melanogaster avevano ridotto successo di accoppiamento. Il metodo di tintura presentato è applicabile ad un'ampia gamma di modelli sperimentali.

Introduction

Negli ultimi decenni si è registrato un crescente interesse in modo sessuale selezione e competizione tra maschi impatto sull'evoluzione 1,2. Esperimenti sul comportamento di accoppiamento hanno svolto un ruolo importante nello sviluppare e testare le teorie di selezione sessuale 3,4. In particolare, la ricerca con le specie del genere Drosophila, ha contribuito notevolmente alla comprensione di selezione e il comportamento sessuale. Tuttavia, è importante indagare se tecniche comunemente utilizzate potrebbero influenzare artificialmente i risultati di esperimenti di accoppiamento standard di 5,6.

Anestesia è spesso usato per la gestione e l'identificazione in esperimenti 7. Ad esempio, le mosche sono comunemente raccolti prima dell'accoppiamento, o ordinate in genotipi o trattamenti sperimentali che utilizzano anidride carbonica (CO 2) anestetico. Negli esperimenti in cui è necessario distinguere due o più individui, è pratica comune per anestetizzare il flIES e clip parte dell'ala off per identificare ogni individuo o gruppo di trattamento 5,8. E 'fondamentale, però, per capire come CO 2 trattamento sarà influenzare il comportamento. L'effetto di CO 2 l'anestesia è stata esaminata in Drosophila melanogaster in cui i maschi esposti a CO 2 ha preso molto più tempo per accoppiarsi e nel complesso è stata il successo di accoppiamento inferiori rispetto ai maschi non anestetizzato o maschi anestetizzati con l'esposizione al freddo 5. Questo effetto è stato osservato sia quando l'anestesia è stata applicata il giorno dell'esperimento e quando le mosche hanno dato un giorno per recuperare. Tuttavia, questo studio è stato limitato in studi solo esame in cui un singolo maschio è stato presentato ad ogni femmina 5. Uno scenario più realistico è per una femmina di incontrare più maschi 9,10, permettendo la concorrenza tra i maschi, il che potrebbe permettere il rilevamento di perdite più sottili del fitness maschile a causa di anestesia. L'uso di anestesia CO 2 è anche essereen trovato per ridurre la fecondità e la longevità di adulti D. melanogaster quando sono esposti poco dopo eclosion, come è comune nella raccolta vergine vola 11.

Un'alternativa di CO 2 l'anestesia è di marcare le mosche somministrando loro cibo colorato con tinture 4,6,10,12,13. Questo colorante entra l'intestino della mosca ed è visibile attraverso l'addome, permettendo mosche colorate per distinguere dalle mosche incolore, o da mosche etichettati con un colore diverso. Metodi differiscono in quanto questo può essere applicato: viene aggiunto direttamente al cibo 12, tramite tinto pasta lievito complementare 6, o mediante esposizione ad un romanzo tinto alimentare substrato 13. Queste tecniche di marcatura sembrano mostrare alcun effetto sulle prestazioni di accoppiamento 4,6. Tuttavia, un documento esaminare direttamente gli effetti dello stesso colorante alimentare su adulto D. melanogaster trovato una forte riduzione della durata della vita 14. Il lavoro precedente ha anche concentrato almost interamente su D. melanogaster, sia per quanto riguarda gli effetti di CO 2 anestesia 5,11 e colorante alimentare 14 metodi. Attualmente, ci sono poche informazioni su come CO 2 anestesia o l'uso di coloranti intestinale colpisce il comportamento di accoppiamento di altri Drosophila.

Il seguente studio valuta l'effetto di CO 2 anestesia sul comportamento di accoppiamento di tre specie di Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, e D. subobscura). L'effetto di raccogliere mosche su di CO 2 è stata esaminata sia in singolo e due prove di accoppiamento maschi. L'effetto della CO 2 è stato trovato anche variare in D. melanogaster 5 e così diversi periodi di latenza tra l'esposizione a CO 2 e l'accoppiamento sono stati testati. Un metodo per l'anestesia e l'ala clipping marcatura alternativa: l'uso di coloranti per colorare linea viene valutata anche.

Protocol

1. Preparazione di Fly cibo con coloranti alimentari Prendere una fiala standard Drosophila con circa 20 ml di cibo sul fondo (Figura 1). Utilizzare la seguente ricetta per la miscela alimentare con 1 L di acqua bollente: 10 g della agar, 85 g di destrosio, 60 g di farina di mais, 40 g di lievito, e agitare per 5 min di ebollizione. Aggiungere 25 ml di 10% nipagen volta la miscela è raffreddata a 75 ° C. Dopo il cibo è raffreddato e solidificato aggiungere due gocce (circa 0,5 – 1 ml) di colorante alimentare blu all'inizio del cibo e si sviluppa su tutta la superficie del flacone (Figura 1). Utilizzare un diverso colore della tintura se si preferisce. Lasciare il cibo per due giorni nel frigorifero in modo che il colorante viene assorbita dallo strato superiore di cibo; questo evita eccessiva umidità danneggiare le mosche durante il periodo di maturazione. Aggiungere un piccolo pezzo di carta velina, se eccessiva umidità è ancora un problema per cancellare l'umidità in più e poi successivamenterimuoverlo. Trasferimento vola sul cibo singolarmente o in gruppo. Nota: Le mosche guadagneranno colorazione intestinale entro 1 giorno di essere immessi sul cibo. In alternativa, maturare pienamente le mosche sul cibo tinto prima dell'esperimento (aumento della mortalità durante il periodo di maturazione non è stata osservata dall'esposizione al colorante alimentare). Verificare che le mosche colorate possono essere facilmente distinta dalle mosche non tinti. Se non possono essere distinti, ripetere i passaggi 1,1-1,4 usando una maggiore concentrazione di colorante o un colorante diverso. 2. Due Prove di accoppiamento maschio con colorante alimentare Per la produzione di progenie, impostare più fiale contenenti coppie di mosche femminili e maschili (piccoli gruppi di uomini e donne sono anche adatti, anche se fare attenzione per evitare l'affollamento delle larve). Lasciare le femmine depongono le uova e si muovono in linea di nuovi flaconi ogni 5 – 7 giorni. Conservare le fiale a una temperatura adatta per la specie di interesse (22 ° C fo D. pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C per D. melanogaster). Prima di raccogliere le mosche sperimentali rimuovere tutte le mosche dai flaconi di raccolta in un tempo stabilito prima di raccogliere i maschi e femmine per assicurare che saranno vergini (D. melanogaster – 6 ore a 25 ° C, D. pseudoobscura – 18 ore a 22 ° C, e D. subobscura – 24 ore a 22 ° C). Nota: se le mosche non sono vergine questo pregiudizio volontà il loro comportamento nelle prove di accoppiamento 15. Conservare e maschio maturo individualmente in fiale standard di 75 x 20 mm plastica (contenente ~ 20 ml di cibo). Questo evita gli effetti negativi sul comportamento di accoppiamento maschio e fitness visto in alcune specie quando i maschi sono allevati in gruppi di 16. Esporre metà dei maschi per il trattamento desiderato (CO 2 anestesia in questo caso). Utilizzare un tappetino di CO 2 o toccare per esporre le mosche per il tempo necessario. Conservare la metà del males in ogni trattamento il cibo colorato fino l'accoppiamento avviene. Questo li renderà visivamente distinguibili durante le prove di accoppiamento. Per il trasferimento di mosche utilizzare un aspiratore 17. Etichettare ogni flaconcino per identificare sia il trattamento e lo stato del colore del maschio. Qui, utilizzare quattro trattamenti (anestesia, non-color = G-NC, anestesia, colorato = GC, no anestesia, non colorato, NG-NC, e senza anestesia, colorato, NG-C). Trasferire femmine nuovi emersi in fiale alimentari freschi a maturare come gruppi di 10. Lasciare le mosche a maturare all'età di accoppiamento (D. melanogaster – 3 giorni, D. pseudoobscura – 5 giorni, D. subobscura – 7 giorni 18 Conservare vola ad una temperatura adatta per la specie in fase di studio (ad esempio, 22 ° C per D. . pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C per D. melanogaster). Spostare le femmine a singoli flaconi (containing ~ 20 ml di cibo) 1 giorno prima del processo di accoppiamento per l'acclimatazione al flaconcino di accoppiamento. Etichetta queste fiale in modo che fiale possono essere differenziati. Attenzione accecare l'esperimento utilizzando etichettatura neutra (cioè, 1 – 150) in modo che non è possibile indovinare l'identità di linea in ogni flaconcino. Nota: Il soggetto che immette in linea in ogni fiala dovrà conoscere l'identità delle mosche collocati in ogni fiala in quanto saranno notare che il trattamento era macchiato. Tuttavia, l'osservatore che guarda l'accoppiamento non deve conoscere la loro identità. Per farlo sarà necessario questo almeno due sperimentatori, una da installare e di osservare. Iniziate le prove di accoppiamento tra 10-12 del mattino, o in un momento che coincide con la luce proveniente sul nel ciclo luce / buio linea sono esposti a ("alba" per linea). Aggiungere due mosche maschio per ogni flacone di accoppiamento (che contiene una mosca femminile) con un aspiratore. Assicurarsi che i due maschi sono da diversi trattamenti (anestesia ocontrollo) e che uno ha colorazione intestinale per permettere di distinguerli l'uno dall'altro, e scrivere che maschile è macchiato. Se si verifica copulazione, registrare lo stato del maschio che si accoppia (colorato o non – colorati). Se le prove durano 2 ore, assumono la femmina non si accoppiano. Nota: 2 ore è adatto per queste specie, ma altri Drosophila potrebbe essere necessario più o meno tempo. 3. Uomo singolo Trials accoppiamento Per gli studi maschi singoli, ripetere protocollo 2 con due modifiche: Al punto 2.3 non tenere i maschi sul cibo colorato. In fase 2.7, aggiungere un solo maschio per ogni flacone. Nel passo 2.8, registrare il tempo di volo viene aggiunta alla fiala, il tempo inizia accoppiamento e il tempo dell'accoppiamento finito devono essere registrati. Da questi valori, calcolare accoppiamento successo, la latenza, e la durata. Analisi 4. Dati Utilizzare software statistico adatto per analisi. Se i dati sono normali e hanno solo due trattamenti, utilizzare t-test o equivalente modello lineare generalizzato (GLM). Per due esperimenti di sesso maschile, utilizzare i test binomiale o un GLM binomio che sono disponibili in qualsiasi pacchetto delle statistiche di base. Nota: per i dati di esempio, tutte le analisi sono state effettuate in R versione 3.0.3 19. Controllare i dati di latenza accoppiamento e durata di accoppiamento per la normalità, tracciando istogrammi di frequenza di latenza e di durata per ogni trattamento 20, e l'utilizzo di un test per la normalità, come Shapiro-Wilk. Se non è normale, trasformarlo, o utilizzare corrispondenti statistiche non parametrici 20. Nota: per i dati di esempio degli esperimenti maschi singoli log trasformazione soddisfatto i requisiti di normalità e varianze uguali. Se i dati possono essere normalizzati, Usa T-test per esaminare le differenze tra la latenza di accoppiamento e la durata delle prove singole di accoppiamento maschi quando si utilizzano due trattamenti 21. Se si utilizzano trattamenti multipli,provare un analisi della varianza (ANOVA) 20. Se i dati non possono essere normalizzati, provare equivalenti test non parametrici 21. Utilizzare test binomiale per verificare l'effetto di una colorante alimentare o di CO 2 anestesia sul successo di accoppiamento dei maschi concorrenti 20. Se si utilizzano più trattamenti, come è il caso con i dati di esempio, utilizzare un GLM con struttura di errore 21 binomiale. Per le due prove maschili nei dati esempio, utilizzare MLG con strutture errore binomio. Una GLM esaminato colore come una variabile di risposta (colorato = 0, non colorato = 1) con specie, lo stato di gas, e il trattamento di gas installati come esplicativo variables.One GLM esaminato CO 2 come una variabile di risposta (gasati = 0 e non-gassati = 1) con le specie, lo stato di colore e trattamento del gas montati. In ciascun caso, il modello produrre massima, ed eseguire semplificazione modello basato sulla AIC 20.

Representative Results

Due studi accoppiamento maschio – L'effetto di CO 2 anestesia sul comportamento di accoppiamento Il modello più trovato per spiegare la variazione dell'effetto di CO 2 anestesia conteneva specie come fattore (con D. pseudoobscura e D. subobscura fusa come mostrato differenze tra di loro). In D. pseudoobscura e D. subobscura non vi era alcun effetto significativo di CO 2 anestesia sul successo di accoppiamento in due prove maschili (Z 1.589 = 0.087, p = 0,931). Per D. melanogaster, maschi esposti a CO 2 anestesia avuto successo accoppiamento significativamente inferiore (Z1,589 = 2.467, p = 0,014). C'è stata anche una significativa interazione tra le specie e il trattamento (χ 2 1.589 = 6.83, P = 0.009), con un effetto maggiore di essere visto quando D. melanogaster sono stati esposti a gas raccolta o 1 giorno prima prove (Tabella 1). Carner, D. maschi melanogaster esposti a CO 2 due giorni prima del processo sperimentale non hanno mostrato un effetto di CO 2. Due studi accoppiamento maschio – L'effetto della colorazione intestinale sul comportamento di accoppiamento Modello semplificazione non ha mostrato alcun effetto significativo di colorante alimentare essere trovato qualsiasi delle tre specie (p> 0,1). Quando il trattamento o lo stato di gas sono stati inclusi nell'analisi questi erano anche non significative (P> 0,1). Le proporzioni di accoppiamenti successo per linea colorata attraverso trattamenti sono riportati nella Tabella 2. La differenza di colorazione tra mosche conservata a colorato e il cibo non colorato può essere visto in Figura 1. L'intensità del colorante alimentare intestinale era maggiore in D. pseudoobscura e D. subobscura che in D. melanogaster. Prove di accoppiamento singolo – L'effetto di utilizzare CO 2 anestesia su mcomportamento ope- Non c'era differenza nella latenza di accoppiamento per una delle tre specie quando di CO 2 l'anestesia è stato utilizzato per raccogliere recentemente emerse adulti. Un effetto è stato trovato per la durata accoppiamento in D. subobscura quando è stato esposto a CO 2 due giorni prima prove di accoppiamento (figure 2 e 3, Tabella 2). Figura 1. Fotografia che mostra Fiale di colori e non colori Fly alimentari (A) e la forza della intestinale Colorazione a Male D. Subobscura (B). Figura 2. La media e il 95% intervallo di confidenza per accoppiamento di latenza per le tre specie effettuati studi singolo maschio, quando i maschi erano anestetizzared (barre chiare) o non anestetizzati (barre scure) quando raccolti come Virgins prima della maturità sessuale. Figura 3. La media e il 95% intervalli di confidenza per accoppiamento Durata per le tre specie effettuati studi singolo maschio, quando i maschi sono stati anestetizzati (barre chiare) o non anestetizzati (barre scure) quando raccolti come Virgins prima della maturità sessuale. Trattamento Specie No. prove No. mosche colorate che si sono accoppiati p-value No. mosche gassate che si sono accoppiati p-value Collezione di CO 2 D. mel 73 36 1 27 0,0344 D. pse 79 41 0,8221 44 0,3682 D. sub 71 40 0,3425 33 0,6353 Esposto alla CO 2 18 ore prima D. mel 57 28 1 19 0,0163 D. pse 65 32 1 31 0,8043 D. sub 68 38 0,3961 35 0,9036 Esposto a CO 2 due giorni. D. mel 56 19 0,0222 32 0,3497 D. pse 70 32 0,5504 33 0,7202 D. sub 56 29 0,8939 26 0,6889 </ Td> Tabella 1. I risultati di due esperimenti Maschio Choice in tutte le specie e trattamenti esaminati. Specie Tratto df t-valore p-value D. melanogaster Latenza 58 1.379 0,174 Durata 58 1.243 0,221 D. pseudoobscura Latenza 109 0,419 0,676 Durata 109 0,436 0,664 D. subobscura Latenza 83 0,098 0,922 Durata 83 1.767 0,081 Tabella 2. I risultati di esperimenti di accoppiamento singoli a studiare gli effetti della raccolta di CO 2 Anestesia sulla latenza di accoppiamento e la durata. Le prove sono state effettuate su tre specie di Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura e D. subobscura).

Discussion

Questi dati mostrano che l'impatto dell'anestesia CO 2 è coerente tra le specie, con due delle tre specie mostrano scarso impatto. I nostri risultati suggeriscono l'etichettatura con il colorante alimentare ha avuto un minor impatto sul successo di accoppiamento maschio di CO 2 per l'anestesia D. melanogaster. Questi esperimenti dimostrano che i coloranti alimentari possono facilmente ed economicamente essere utilizzati per le mosche di etichette per le prove di accoppiamento che coinvolgono più maschi.

Delle tre specie modello Drosophila esaminati, solo D. melanogaster ha mostrato un effetto di CO 2 anestesia sulle prestazioni di accoppiamento in una situazione di concorrenza. Al contrario, nessuna delle specie ha mostrato un effetto di raccolta gas in studi singoli accoppiamento in termini di latenza accoppiamento, contrariamente ai risultati precedenti per D. melanogaster 5. L'effetto della concorrenza potrebbe quindi essere evidenziando effetti di fitness più sottili di anestesia CO 2, che sono solo rilevabiliin situazioni in cui vi è una concorrenza maschio-maschio. L'esposizione a raccolta precoce e un giorno prima del processo hanno un effetto negativo sulla capacità dei maschi di D. melanogaster per ottenere un accoppiamento. Esposizione due giorni prima del processo, tuttavia, non ha mostrato alcun effetto. Entrambi D. pseudoobscura e D. subobscura non ha mostrato alcun effetto di esposizione a gas in qualsiasi delle prove. Una spiegazione è che D. melanogaster era vulnerabile a precoce esposizione al CO 2 perché deve essere raccolto in precedenza in vita (0-6 ore di età) rispetto alle altre specie per garantire i maschi sono vergine. Quindi maschio D. melanogaster di questa età può essere più sensibile la cuticola della mosca è ancora indurimento, rispetto alle altre specie che hanno avuto più per la loro cuticola per indurire. In generale, questo sostiene l'idea che gli effetti di CO 2 anestesia sono specie specifici e investigatori dovrebbero adeguatamente testare l'effetto in loro specie bersaglio. Correntely, la maggior parte del lavoro sull'effetto di CO 2 anestesia è stata effettuata su Drosophila melanogaster 5,11,22 e quindi non può essere opportuno applicare alle altre specie affini.

Il metodo non invasivo alternativa presentata a differenziare le mosche è colorante alimentare. I risultati suggeriscono questo trattamento non ha avuto effetto in in tutte le specie esaminate. Tuttavia, mentre il suo uso è riuscita a fornire un marker economico e facilmente visibili distinguere tra individui va osservato che il colorante era facile distinguere in D. pseudoobscura e D. subobscura che in D. melanogaster. Precedente autori hanno utilizzato diversi colori (rosso, verde e blu) 4,6. Abbiamo trovato colorazione blu per essere il più facile distinguere in tutte le specie, particolarmente D. pseudoobscura e D. subobscura. Utilizzando diversi colori potenzialmente consentire esperimenti più complessi con molti marcati individualmente flies. Tuttavia, i test preliminari di diversi coloranti sono essenziali, come alcuni coloranti alimentari non riescono a colorare le mosche, forse essere digerito se consumato. Altri coloranti possono avere effetti tossici e ridurre la sopravvivenza delle mosche, e dovrebbero essere evitati 14). Metodi coloranti alimentari alternativi utilizzando le macchie più costosi sono stati utilizzati anche per l'esame di integrità intestinale per D. melanogaster 23. Questi possono fornire un'alternativa, anche se più costoso, metodo di tintura 23.

Il metodo di tintura è il più velocemente di CO 2 ala ritaglio come mosche possono essere memorizzati sul cibo tinto a raccolta. Uptake del cibo era rapida (~ 3 ore), in modo stoccaggio O / N sul cibo colorato sarebbe anche sufficiente a marcare mosche, come usato in altri studi 6. Tuttavia, la durata della colorazione è relativamente breve (~ 4 – 5 ore) rispetto al centro di clipping (permanente) o polvere fluorescente marcatura (10 – 12 giorni) 24. Come Drosophila specievari in apparenza, diversi coloranti saranno più o meno efficace per le specie diverse, e alcuni ceppi (ad esempio, mutanti knock-out) possono essere sensibili a cambiamenti nella dieta, qualsiasi uso di colorante richiede una prova preliminare della sua efficacia soprattutto se più esposizione a lungo termine ai coloranti può essere tossico 14. In contrasto studio di Kalaw et al. 14, abbiamo trovato alcuna significativa mortalità dopo stoccaggio per più giorni sugli alimenti colorati per D. melanogaster (3 giorni), D. pseudoobscura (5 giorni), o D. subobscura (7 giorni), probabilmente a causa della differenza di colorante utilizzato.

Il passo fondamentale per utilizzare con successo la tecnica di tintura è passo 1.5, convalida che il colorante prescelto funziona bene con le specie e del ceppo utilizzati. Una tecnica alternativa comporta l'applicazione di polvere colorata all'esterno della mosca prima dell'uso in esperimenti di campo 24. Questo metodo è stato utilizzato per l'inseguimento individui nel campo a causa to la durata di marcatura e la facilità di massa marcatura 24 mosche. Anche se non abbiamo testato in modo esplicito questo metodo negli studi di accoppiamento, sarebbe importante esaminare gli effetti che la polvere potrebbe avere sui sensi importanti in accoppiamento, in particolare in Drosophila 25, 26. In specie, invece, dove la tintura intestinale non è possibile, questi metodi potrebbero essere adatti.

In conclusione, abbiamo scoperto che in due delle tre specie testate (D. pseudoobscura e D. subobscura) non vi è stato alcun effetto trovato su entrambi CO 2 anestesia o colorante alimentare sulla capacità di accoppiamento dei maschi. Per D. melanogaster un effetto negativo di CO 2 anestesia è stato rilevato, ma colorante alimentare non ha influenzato l'accoppiamento successo in questa specie. In generale, il metodo della tintura fornisce un metodo non invasivo semplice ed economico per identificare singoli Drosophila equivalente o migliore di metodi che richiedono CO 2 anestesia. Essoè probabile che questo metodo avrebbe funzionato in una vasta gamma di specie.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Alex Hitchen e Meg Booth per il loro aiuto con le prove di accoppiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da NERC concessione NE / H015604 / 1 a TP.

Materials

Plastic tubing Fisher Scientific TWT-200-061G Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.
Fine mesh Any haberdashery – Fine curtain mesh is suitable
1ml pipette tips VWR 83007-376 Various brands of pipette tips would be suitable
Plastic Vials Sarstedt 58.49 Larger vials or bottles could also be used.
Cotton Balls Lewis Medical Solutions 28170 The size of cotton will vary depending on the size of vials used
Blue Food colouring Thesugarcraftcompany – Other dye colours and brands can have variable results.
CO2 Tank BOC BOC 40VK
Sharpie Markers Steadtler Lumocolor 313 S Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness
Stopwatch Salter SL3920 Any stopwatch with a good digital display would be fine
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Referências

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DrosophilaMating BehaviorBehavioral AssaysFood ColoringLabelingCO2 AnesthesiaNon-invasiveSpecies Comparison

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Verspoor, R. L., Heys, C., Price, T. A. R. Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila. J. Vis. Exp. (98), e52645, doi:10.3791/52645 (2015).
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