פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
עובר מוקדם החל מהזיגוטה תא בודדת עובר דרך חלוקת תאים מהירה והמורפוגנזה, ומאופיין מורפולוגית בשלבים טרום-כדורי, כדורי, לב, טורפדו וטבורית. פיתוח מתקדם זה הוא תחת הרגולציה ההדוקה של רשת מולקולרית מורכבת. קציר עוברים מוקדם מספיק בשלב דומה של פיתוח הוא חיוני לחקירת הוויסות התאית ומולקולרית של עובר מוקדם. זה לא פשוט מאז עובר מוקדם עובר המורפוגנזה מהירה בזמן קצר לדוגמא 8 ימים לMedicago truncatula להגיע שלב טבורית המוקדם. כאן, אנו מתייחסים לנושא בשתי גישות. הראשון קובע זיקה בין התפתחות עובר ומורפולוגיה תרמיל בסיוע מצביע על השלב של עובר zygotic. זה מבוסס בעיקר על מספר ספירלות תרמיל והפיתוח של עמוד השדרה. דרך חלופית כדי להשלים את in vivo שלtudies הוא באמצעות explants עלה culturing לייצר עוברים גופניים. הבינוני כולל שילוב הורמון יוצא דופן – אוקסין (חומצת 1-naphthaleneacetic), ציטוקינין (6-benzylaminopurine), חומצת abscisic וחומצת gibberellic. ניתן להבחין בשלבים השונים הצומחים מתוך היבלת ללא נתיחה.
Introduction
קטניות הן המשפחה השלישית בגודלה של צמחים גבוהים עם כ -20,000 מינים ומשפחת בלאגאמינוסא (או Fabaceae) הם שני לדגנים באזור שנקטפו וייצור כולל 1. סויה היא היבול טיפח השלישי בגודלה. קטניות דגנים מספקות כשליש מחלבון תזונתי ושליש משמן צמחי למאכל אדם 2. קטניות עם קיבולת תיקונם N 2 גם לתרום למערכות חקלאיות ברות קיימא. Truncatula Medicago, כמו סויה, חלבון חנויות ונפט בפסיגים של הזרעים והוא מודל קטניות גנטי והגנומי עם משאבים גנטיים והגנומי רבים 3,4. בעוד מ ' truncatula אפשר התקדמות בהבנת הסימביוזה הקטניות-rhizobium 4 זה כבר מועסק יותר ויותר ללמוד ביולוגיה זרע קטניות 5-7 ועובר 8,9. עובר ארבידופסיס נחקר בהרחבה 10,11 אבל זה אניללא קטניות sa ואת הפרטים של עובר אינן זהות לMedicago 8,10. עובר Zygotic במ ' יש truncatula תכונות מעניינות, עם היפופיזה ייחודית רב-תאית, suspensor endoployploid ותא העברת בסיס 8.
עובר סומטי (SE) משמש בדרך כלל לחידוש צמחים 12. במודל הקטניות מ ' truncatula, קו זרע Jemalong 2HA (2HA) פותח מההורה Jemalong יש שיעור גבוה של עובר גופני 13. לאחרונה מספר העוברים שיוצרו כבר עלה באופן מהותי על ידי הוספת שתי חומצת gibberellic (GA) וחומצת abscisic (ABA) למדיום הוותיק 14. במקרה זה GA ומעשה ABA בסינרגיה, שהוא יוצא דופן בהתחשב בכך שGA וABA בדרך כלל לפעול באיבת 14. העוברים המופקים מיבלת לפתח על פני השטח המאפשר לשלב של עובר להיות בקלות נקבע visually ונקטף בקלות. לאחר ליד קווי isogenic שembryogenic (2HA) ולא embryogenic (Jemalong) מאפשרת החקירה של עובר גופני ושיש שני in vivo ובמערכות מבחנה מספקת אפשרויות ניסויים שונות.
הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של התפתחות עובר היא חיונית לזרע הבנה והתפתחות צמח. בקטניות, כמו בdicotyledons האחר, זה הפסיגים של העובר שלאחסן את המוצרים המשמשים לתזונת אדם. עובר מוקדם כרוך חלוקת תא מהירה, ודפוסי עובר נכונים. בכ 8 ימים לאחר ההפריה, מ ' עובר truncatula מגיע שלבים מוקדמים טבורית. אפיון מורפולוגי לא הצביע בדיוק על ידי ימים לאחר הפריה בתנאי חממה. לפיכך, גישה סטנדרטית יעילה כדי לציין את השלב של עוברים מתפתחים היא רבת ערך בלימוד regul הגנטיני של עובר zygotic המוקדם.
במאמר זה, אנו מספקים שני פרוטוקולים סטנדרטיים לאסוף עוברים מתפתחים למחקרים ביולוגיים של עובר במודל הקטניות מ ' truncatula. הראשון הוא לאסוף עוברי zygotic ידי שיוך מורפולוגיה עובר ותרמיל ואילו השני הוא עובר גופני באמצעות explants עלה culturing לספק מספרי עובר גדולים לגשת בקלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים שתוארו הם יחסית ישר קדימה ולאפשר חקירה של עובר קטניות עם כל התא העכשווי וטכניקות מולקולריות. אנו מכירים בכך שיש יתרונות וחסרונות של שני in vivo ובגישות חוץ גופית. שני לאפשר יותר דגש על עובר מוקדם בהשוואה לתרבות של זרעים בשלים 19.
<p class="jove_content" style="…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
Referências
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula – implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
