Протоколы Получение зиготических и соматических эмбрионов для изучения Положение раннего развития эмбрионов в Типовом бобовых<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
Раннего эмбриогенеза, начиная с одной зиготы клетки проходит быстрого деления клеток и морфогенеза, и морфологически характеризуются предварительно шаровидные, шаровых, сердце, торпедных и семядольных этапов. Это прогрессивное развитие находится под жесткой регуляции сложной молекулярной сети. Сбор достаточно ранние эмбрионы на аналогичной стадии развития имеет важное значение для исследования клеточного и молекулярного регулирование раннего эмбриогенеза. Это не просто, так как в начале эмбриогенеза подвергается быстрому морфогенез в короткое время например 8 дней для Medicago truncatula достичь ранней стадии семядолей. Здесь мы решить проблему двумя подходами. Первый устанавливает связь между развитием эмбриона и под-морфологии, помогая указать этап зиготического эмбриона. Это особенно на основе количества стручка спиралей и развитие шипов. Альтернативный способ, чтобы дополнить в естественных условиях сtudies осуществляется через культивирование листовых эксплантов для получения соматических эмбрионов. Носитель содержит необычное сочетание гормона – ауксин (1-нафталинуксусной кислоты) цитокинина (6-бензиламинопурина), абсцизовой кислоты и Гиббереллиновая кислоты. Различные этапы можно выделить растущие из каллуса без вскрытия.
Introduction
Бобовые третий по величине семейство высших растений с примерно 20000 видов и (или) Fabaceae семейства бобовых являются второй зерновых в области собрано и общий объем производства 1. Соя является третьим по величине урожай выращивается. Зерновые бобовые обеспечить около одной трети диетического белка и одной трети растительного масла для потребления человеком 2. Бобовые с их N 2 крепления емкости также способствуют устойчивых сельскохозяйственных систем. Medicago truncatula, как соя, магазины белка и масла в семядолях его семян и генетических и геномных модель бобовых со значительными генетическими и геномных ресурсов 3,4. В то время как М. truncatula позволило достижения в понимании бобово-Rhizobium симбиоз 4 было больше используются для изучения бобовых семян биологии 5-7 и эмбриогенеза 8,9. Arabidopsis эмбриогенез была тщательно изучена 10,11, но это яса небобовых и детали эмбриогенеза не идентичны Medicago 8,10. Зиготических эмбриогенез в М. truncatula имеет интересные особенности, с характерным многоклеточного гипофиза, в endoployploid суспензорные и базальная передачи ячейки 8.
Соматического эмбриогенеза (SE) обычно используется для регенерации растений 12. В бобовых модели М. truncatula, семян линии Jemalong 2HA (2HA) была разработана с родителем Jemalong иметь высокие темпы соматического эмбриогенеза 13. Количество эмбрионов, полученных в последнее время существенно увеличивается при добавлении как Гиббереллиновая кислоту (GA) и АБК (ABA) в давние среды 14. В этом случае А. и ABA синергически, что является необычным, учитывая, что А. и АБК, как правило, действуют антагонистически 14. Эмбрионы, полученные из каллуса развиваются на поверхности, которая позволяет стадии эмбриогенеза, чтобы быть легко определены visuallу и легко собирают. Имея рядом изогенных линий, которые эмбриогенный (2HA) и не эмбриогенный (Jemalong) облегчает исследование соматического эмбриогенеза и имеющий как в естественных условиях и в пробирке систем обеспечивает различные экспериментальные возможности.
Понимание клеточные и молекулярные механизмы развития эмбриона имеет важное значение для понимания семян и развития растений. В бобовых, как и в других двудольных, это семядоли зародыша, что хранить продукты, которые используются для питания человека. Раннего эмбриогенеза включает быстрое деление клеток, и правильное структурирование эмбриона. В примерно 8 дней после оплодотворения, в М. truncatula эмбрион достигает ранние стадии семядолей. Морфологическая характеристика точно не указывается дней после оплодотворения в условиях теплицы. Таким образом, эффективность стандартизированный подход, чтобы указать на сцену развивающихся эмбрионов является ценным в изучении генетического REGULвания раннего эмбриогенеза зиготического.
В этой статье, мы предоставляем два стандартизированных протоколов для сбора развивающиеся эмбрионы для биологических исследований эмбриогенеза в бобовых модели М. truncatula. Первый заключается в сборе зиготических эмбрионов, связывая эмбриогенеза и стручок морфологию, а второй соматического эмбриогенеза с помощью культивирования листовых эксплантов, чтобы обеспечить доступ легко большое количество эмбрионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные относительно прямо вперед, и позволяют исследование бобовых эмбриогенеза со всей современной клетки и молекулярных методов. Мы признаем, что есть преимущества и недостатки как в естественных условиях и в пробирке подходов. Оба позволяют больше внимания …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
Referências
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula – implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
