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Bioengenharia

무 세포 생물학 밀봉 Femtoliter 상공 회의소 배열

Published: March 11, 2015
doi:
10.3791/52616
, , , , , ,
1Bredesen Center,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Nanophase Materials Sciences,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Materials Science and Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Abstract

무 세포 시스템이 복잡한 자원 공유로부터 단리 생물학적 반응의 특정 네트워크를 프로빙 유연한 플랫폼을 제공한다 (예를 들면, 글로벌 유전자 발현, 세포 분열) 살아있는 세포 내에서 발생. 그러나, 종래의 거시 규모의 벌크 반응기에 사용 된 이러한 시스템은 종종 그들의 생활 마이크로 미터 수준의 특성 동태 및 효율을 발휘하지 못한다. 반응 역학에 내부 세포 구조와 규모의 영향을 이해하는 것은 복잡한 유전자 네트워크를 이해하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 동봉 된 분자 시스템의 유연한 특성을 허용하면서 세포 규모 볼륨에서 무 세포 반응을 한정 미세 장치를보고합니다. 이 다층 폴리 (디메틸 실록산)을 (PDMS) 장치 (개방 및 폐쇄) 작동 할 수있는 탄성 중합체 막에 femtoliter 규모의 반응 챔버를 포함한다. 작동시, 챔버는 무 세포 단백질 합성 (CFP들)의 반응을 제한시간 경과 형광 현미경을 사용하여 시간에 따른 반응 속도의 시각화를 허용 형광 단백질을 발현. 여기서 우리는이 장치가 CFP들 유전자 회로를 특성화함으로써, 셀룰러 시스템에서 사용되는 잡음 생물학 기술의 사용을 가능 셀룰러 시스템을 특성화하기 위해 사용 된 것과 직접 유사하게 CFP들 반응의 노이즈 구조를 측정하는데 이용 될 수있는 방법을 보여주고 무 세포 환경과의 상호 작용.

Introduction

무 세포 시스템은 살아있는 세포의 연구에 불가피한 같은 피트니스, 분할, 돌연변이 등의 복잡한 요인이없는 생물학적 반응을 볼 수있는 간단하고 유연한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 접근법은 막 단백질의 한 특성, 단백질 상호 작용이 프로빙 및 평행 3-7의 기본적인 양태의 탐사를 포함한 셀룰러 시스템을 연구하기 위해 사용되었다. 최근 무 세포 시스템은 합성 생물학 (synthetic biology) 8-10에 대한 실행 가능한 플랫폼으로 발판을 마련하기 시작했다. 이러한 접근 방식의 매력은 살아있는 세포의 반응 역학에 영향을 미치는 자원 공유와 '외부 소음'에서 합성 생물학 (synthetic biology)을 확보한다는 것이다. 그러나 문제는 무 세포 반응 매립되는 물리적 환경이 반응의 진행과 결과에 영향을 미치는 방법으로 남아있다. 무 세포 반응 환경 – 특별히 한정 environm세포 관련 볼륨을 접근 엔트 – 제대로 특징으로 남아있다. 무 세포 단백질 합성 (CFP들)은 리터 규모의 반응 부피 11 마이크로 리터의 범위에 걸쳐 동등 동력학을 나타내는 '프리 스케일,'종래의 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 셀룰러 스케일 볼륨 반응은 크게 한정 단백질 발현율 (12)에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

확률 무 세포 반응의 성격 – 특히 볼륨 femtoliter 아래에 가도 이러한 시스템 접근 또는이 – 특히 중요 할 수있다. 유전자 발현에 노이즈가 크게 소세포 볼륨 및 부품의 고밀도로서 한정 영향 재산권 중요한 분자의 많은 힘이 매우 낮은 인구 수준으로 – 예를 들어, 하나의 FL 볼륨 내의 대장균 경계만큼 4300 상이한 폴리펩티드 아래 수백 개의 다른 프로모터 (1)의 유도 제어3.이 고유의 잡음은 화성 (14) 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 원동력으로 연루되어있다, 활성 복제 및 대기 시간이 15 용해와 원성 (16, 17) 사이의 λ 파지 결정과 능력 사이의 바실러스 subtillus 결정 사이의 HIV 결정 과 포자 (17). 무 세포 합성 생물학은 세포 유전자 회로 및 네트워크의 확률 적 특성을 탐구하고, 특정 기술 목표를 달성하기 위해 이러한 행동을 조작 할 수있는 기회를 모두 제공합니다. 셀룰러 시스템의 소음 문제가 18~27 잘 연구되어 왔지만, 특히 셀룰러 규모, 무 세포 시스템 (8)의 기본적인 동작 잡음의 작은 탐사가 있었다.

여기에서 우리는 무 세포 합성 생물학 (synthetic biology)의 확률 적 영향의 연구를위한 플랫폼을 제시한다. 이 미세 플랫폼은 femtoliter 규모의 반응 C를 포함빨리 오픈 (및 챔버 중 무료로 확산) 및 상태 폐쇄 (챔버 내에서 제한 반응물) 사이에 전환 할 수있다 hambers. 폐쇄 상태에서는, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 무 세포 단백질 합성 (CFP들) 반응물을 제한하고, 시간 경과 형광 현미경 (28) (도 1)를 사용하여 유전자 발현을 따른다. 우리는 셀 (25)을 특성화하는 데 사용되는 것과 유사한 방식으로 직접적으로 유전자 발현 변동의 스토캐스틱 구조를 측정함으로써 셀이없는 환경을 특성화. 무 세포 반응을 한정하는 비 미세 방법은 소포와 리포좀 29-32, 유 중수 에멀젼 (12), 및 다공성 지지체 (33)를 포함한다. 이들 방법은 제한된 볼륨 (34)의 크기 분포에 대한 제어를 제공하는 반면, 미세 가공 방법은 심지어 나노 스케일에 단단히 지정된 치수 매우 복제 기능을 만든다.더욱이, 이러한 구조는 쉽게 강성 증발 또는 외부 환경의 변화에​​ 민감하지 않고 시간에 따라 추적 될 수있다. 반응이 빠르게 (0시)을 개시하고 나서 시간 명확한 지정을 복잡 반응 개시 다음 반응 챔버를 밀봉 할 수 전작 8,35 미세 가공에 사용되는 컨테이너 디자인. 여기에 제시된 방법을 사용하여, 4-5 분함으로써 잘 정의 된 "0 시간"을 제공하고, 개시하고, 반응 장치에서의 시각화 사이에 필요하다. 프로토콜은 다음의 제조 및 광 리소그래피 장치 조립체, 디바이스 테스트, 및 이미지 분석을위한 방법을 포함하여이 장치를 테스트하기위한 방법을 설명한다.

Protocol

장치 석사 1. 광학 리소그래피 적어도 1 시간 동안 ~ 250 ℃에서 핫 플레이트상에서 깨끗한 실리콘 웨이퍼 탈수. 참고 : 사용자 오류가 발생하는 경우에, 마스터를 준비 할 때 하나 이상의 웨이퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 포토 레지스트 분량을 준비합니다. 사용 1의 비율로 희석으로 SU-8 얇은 : 2015 년 SU-8 포토 레지스트 및 2 SU-8 2015 포토 레지스트의 희석 모두의 분량을 준비합니다. 참고 : 약 1 ㎖의 포토 레지스트는 스핀 코팅 한 웨이퍼 필요하다. 이 마스터를 생성하기위한 세 가지 마스크 패턴을 준비합니다. 하나 패터닝 멤브레인 채널 및 다른 패터닝 반응 챔버 : 멤브레인 마스터 들어, 두 개의 마스크를 준비한다. 제어 밸브 마스터를 들어, 하나의 마스크 패턴을 준비합니다. 참고 : 마스크 패턴을 포함 리소그래피 기술에 대한 자세한 내용은, 장치 설계에 대한 자세한 설명은 이토 오카자키, 2000 년 36 참조 Fowlkes 및 콜리어, 2013 참조 (37). 막 마스터 준비 스핀 코트 2 : 45 초 동안 1,000 rpm에서 웨이퍼에 1 SU-8 2,015 포토 레지스트 희석. 2 분 95 ° C에서 소프트 베이킹 웨이퍼. 콘택트 얼 라이너를 사용하여, 10 초 동안 채널 막 패턴으로 웨이퍼를 노광하고, 95 ℃에서 2 분 동안 노광 후 베이킹을 수행한다. 1 분 동안 SU-8 현상액에 웨이퍼를 개발, 또는 포토 레지스트 잔류 물을 제거 할 때까지. 위에서 아래로 이동, 이소프로판올로 웨이퍼를 씻어. 다시 위에서 아래로 이동 질소로 건조 웨이퍼. 4 분 동안 180 ° C에서 구워 웨이퍼. 45 초 동안 2,000 rpm에서 1 SU-8 희석 : 스핀 코트 2 다시 웨이퍼를 패턴 화합니다. 소프트 베이크는 95 ° C에서 2 분 동안 웨이퍼를 패턴 화합니다. 연락처 정렬을 사용하여, 반응 챔버 패턴 패턴 웨이퍼를 정렬하고 10 초 동안 노출. 95 ° C에서 2 분 동안 노출 후 베이킹을 수행합니다. 단계 1.4.3에 설명 된대로 웨이퍼를 개발한다. 4 분 동안 180 ° C에서 웨이퍼, 웨이퍼를 현상 베이크 및 건조 후에. 주 : 웨이퍼는 이전 단계에서 사용 된 것과 동일한 현상에 개발 될 수있다. 제어 밸브 마스터 준비 스핀 코트 45 초 동안 2,000 rpm에서 깨끗한 웨이퍼에 SU-8 포토 레지스트를 희석하지 않았을. 6 분 95 ° C에서 소프트 베이킹 웨이퍼. 콘택트 얼 라이너를 사용하여, 10 초 동안 제어 밸브 패턴 웨이퍼를 노출. 6 분 동안 95 ° C에 노출 후 베이킹을 수행합니다. 2 분 동안 SU-8 Developer에서 웨이퍼를 개발, 또는 잔류 물이 제거 될 때까지. 위에서 아래로 이동, 이소프로판올 씻어. 4 분 동안 180 ° C에서 질소와 빵을 건조 웨이퍼. 2. PDMS 소자 제조 증착을 통해 0.2 ml의 트리메틸 클로로 실란 ~에 모든 마스터를 silanization합니다. 빠르게 silanizing 에이전트의 몇 방울을 실온에서 밀폐 용기에 마스터로 묶습니다. 참고 :. 다른 silanizing 프로토콜이 수용 될 수있다 (38)의 경우 수행 properlY는 PDMS는 쉽게 제거 할 수있을 것입니다. 유사한 적층 밸브에서 입증 된 바와 같이 (39)를 설계, 장치 및 제어 밸브 멤브레인 층 모두에 대해 상이한 비율로 상용 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS) 및베이스 경화제를 혼합한다. 1과 5 : 기본 1 비율 : 20을 사용하여 멤브레인 및 제어 밸브 금형에 대한 경화제, 각각. 멤브레인 금형 경화제 0.5 g과 10 g의 염기를 혼합한다. 참고 :이 볼륨이 막 마스터에 스핀 코팅됩니다. : 1 비율 제어 밸브 금형, 5 기재와 경화제를 혼합한다. 제어 밸브 마스터를 보유하는 데 사용되는 용기에 따라 달라진다 제어 밸브 성형이 필요한 PDMS의 양; 마스터는 PDMS의 ~ 1cm로 코팅되도록 컨테이너 채우기. 철저히 기포가 보이지 않을 때까지 모두 진공 챔버 내에 제제, 탈기 PDMS 이들을 혼합한다. 내열성에 제어 밸브 마스터 배치용기, 유리 접시 등. 한 비 마스터 위에 PDMS, 탈기 용기 번째 시간 : 5를 조심스럽게 붓는다. 제어 밸브 PDMS 용기가 탈기되는 동​​안 스핀 코트 20 : 신중 기포 형성을 최소화하기 위해 멤브레인 마스터 상에 PDMS 혼합물 부어서 막 마스터 1 비율 PDMS 후 회전 도포 마스터를 1,000 rpm에서 45 초 동안. 부분적 멤브레인 마스터 6 분 제어 밸브 마스터 15 분 동안 80 ° C의 오븐에서 두 마스터를 경화. 참고 : 부분적으로 경화 된 경우, PDMS는 그 형태를 유지해야하지만, 재료가 약간 끈적 될 것입니다. PDMS가 아직 경화되지 않은 경우 누르면 재료가 그 형태를 보유 할 때까지 시간에 몇 분의 간격으로 다시 굽는다. 멀리 부드럽게 금형을 필링, 제어 밸브 마스터에서 직사각형 PDMS 금형을 잘라. 0.75 mm의 구멍 펀치를 사용하여 성형 구성 요소를 통해 유입 구멍을 뚫습니다. 참고 : 구멍은 23 게이지 blun를 삽입하여 정리 될 수 있음필요한 경우 t 팁 바늘, 몰드 외부는, 셀로판 테이프로 정리 될 수있다. 멤브레인 마스터 반응 챔버를 찾을 반응 챔버 막의 기능 제어 밸브 주형 부재를 정렬하고 멤브레인 마스터 위에 직접 제어 밸브 구성 요소를 배치하기 위해 광학 현미경을 사용. 장치의 왼쪽 아래 모서리에 제어 밸브 입구의 방향을, 상기 반응 챔버와 멤브레인 마스터 채널 직사각형 컨트롤 밸브 내부의 볼 수 있도록 보장한다. 2 시간 동안 80 ° C에서 정렬 된 주형 부재를 굽는다. 참고 : 막 및 제어 밸브 금형 지금 함께 밀봉, 하나의 금형으로 조작 할 수 있습니다. 멤브레인을 천공하지 않도록 아주 부드럽게 마스터로부터 멀리 몰드를 박리 멀리 멤브레인 마스터로부터 계층화 PDMS 몰드 컷. 입구 펀치 및 0.75 mm의 펀치 구멍을 사용하여 세포 추출물 입력 용 구멍 출구. 두 레이어를 통해 구멍을 펀치,단계 2.6에 기재된 바와 같이 동일한 방식으로 세척. 유도 결합 플라즈마 클리너, 플라즈마 치료 모두 금형 (막면이 위로) 20 초 동안 10.5 W에서 0 번 유리 커버 슬립을 사용. 즉시 플라즈마 세정기로부터 주형 및 커버 슬립을 제거하고, 유리와 금형 사이에 공기 포켓을 최소화하기 위해 시도하는, 유리쪽으로 막 측 구성 요소 층을 포함한다. 멤브레인 입력 채널에 직접 누르지 않거나 막 어렵게 값와 채널을 채우는 데있어 유리 어닐링있다. 유리 층을 파손되지 않도록 조립 장치를 취급 할 때 특별한주의하십시오. 장치가 고배율 오일 침지 사용 목표 유리 커버 슬립으로 묘화해야 얇은 커버 글라스를 사용 – 유리가 너무 두꺼우면, 장치 기능이 보이지 않을 수있다. 마지막으로, 2 시간 동안 80 ° C에서 완성 된 장치들을 경화. 3. 실험 설정 FOR 무 세포 단백질 합성 반응 1 시간 동안 탈 이온수에 끓는 장치 수화물. 참고 : 완전히 수화 때 장치는 흐린 모습이 있어야합니다. 장치는 또한 수분을하기 위해 RT에서 멸균 물에 O / N을 남아있을 수 있습니다. 배양 챔버와 도립 현미경을 사용하여, 30 ° C로 주위 온도를 설정한다. 참고 :이 온도는 너무 다른 반응을위한 최적의 온도가 40 다를 수 있습니다, T7 프로모터와 GFP의 발현을 최적화하기 위해 선택되었다. 마운트 장치는, 셀로판 테이프로 스테이지 홀더를 현미경 및 로컬 수화를 유지하기 위해 습윤 티슈 종이 장치의 에지를 래핑한다. 제어 밸브 활성화 및 시약 입력 용 질소 가스의 압력을 조절하기 위해 두 고정밀 폐쇄 – 루프 전압 압력 변환기를 사용한다. 참고 : 다른 불활성 가스를 사용할 수있다하지만이 프로토콜은 저 순도 질소로 테스트되었습니다. 하여 제 1 변환기를 연결합니다격막 뚜껑이있는 4 ㎖의 유리 병에서 열린 물이 저수지에 24 게이지 PTFE 튜브. 무딘 팁 23 게이지 바늘로 끝나는 제 2 튜브를 사용하여 제어 밸브 입구에 리저버를 연결한다. 참고 : 두 튜브는 두 개의 날카로운 23 게이지 바늘 저수지 격벽을 관통. 남성 대 남성 루어-LOK 커넥터에 연결 24 게이지 PTFE 튜브에 의해 제 2 변환기를 연결합니다. 각 장치에 대해 개별적으로 조립 된 다른 23 게이지 뭉툭한 팁 바늘과 튜브로 연결된 루어 코리아 23 게이지 바늘이 부착합니다. 이 바늘 막 반응 채널에 연결; 반응 채널 및 입력 시약으로부터 물을 세척하기 위해 사용. 무 세포 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조사의 지침에 따라, 얼음에 반응 CFP들에 대한 구성 요소를 조립한다. 얼음에 CFP들 시약을 보류하​​는 데 소요되는 시간을 최소화하고 조립 후 즉시 장치에 반응을 배치합니다. 참고 :이 장치는있다상업 E. 사용 대장균은 단백질 발현 키트와 구조적으로 GFP를 발현하는 플라스미드를 추출합니다. 총 반응 부피는 25 μL로 확장 하였다 – 이는 필요한 경우, 반응물 더 낮은 볼륨을 사용하는 것이 가능할 수있다. CFP들 시약 사이클 동결 – 해동에 민감한 경향으로서, 실험 전에 적절한 음량으로 시약을 분주하는 것이 도움이 될 수있다. 다른 시약은 반응 혼합물에 첨가 될 수 있지만, 완전히 반응 장치에 적용되기 전에 조립되어야한다. 마지막 DNA 입력을 첨가하여 반응을 조립한다. 참고 : 에펜 도르프 튜브에 조립하면 얼음에 개최하지 않을 경우, CFP들 반응이 시작됩니다. 이 문제 해결을 일관 실험 사이 척도 및 보조제를 유지할 – 시간이 장치에 시약을 적용하고 실험 다를 수 시작 취해진 이후 반응을 모아 혼합되면, 타이머를 시작하는 것이 도움이된다. 사용단계 3.4.2에서 설명 배관 및 바늘 커넥터, 1ml의 주사기를 이용하여 튜브에 조립 반응을 철회. 반응 챔버의 입구에 뭉툭한 팁 바늘을 삽입합니다. 주사기의 바늘 커넥터를 분리하고 반응 챔버 변환기에 사용 남성 대 수 커넥터에 부착. 채널을 채우기 위해 CFP들 시약에 압력 (<10 PSI)을 적용합니다. 반응이 채워질 때 바늘을 제거한다. 제어 밸브 입구에 다른 변환기에서 무딘 튜브를 삽입합니다. 아직 제어 밸브 압력을 가하지 마십시오. 무대에 장착 된 장치를 놓습니다. 촬상 시야를 사용하여, 100 배 오일 액침 대물 함께 반응 챔버를 찾는. Actuate의 20 PSI로 조절 밸브 변환기를 가압하여 조절 밸브; 제어 밸브가 작동 될 때 막의 가시 변화 명백 ​​할 것이다. 반응 챔버의 바닥에 초점을 맞 춥니 다. 이미지 수집을 시작; 형광의 성장 w가능성이 반응의 초기 단계에서 분명하지 않을 것이지만 병, 내부에 상기 반응 챔버의 외부 주위에 표시. 반응이 정상 상태에 도달 할 때까지 형광 1-3 분마다 이미지를 캡처. 자동 초점 단계를 사용할 수없는 경우, 간단히 이미지가 촬영되기 전에 각각의 이미지를 집중할. 주 : 일부 광표백이 발생되지만, 광표백에 의한 상대적인 형광에 영향만큼의 광표백 레이트가 공지 된 바와 같이 설명 될 수있다. 이 속도는 photobleaching에 일정 기간 동안 일정하게 광표백 그러한 GFP의 공지 농도 또는 형광 단 혼합물로서 형광 표준, 노광에 의해 추정 될 수있다. 취득 된 화상에 상기 제 반응 조립체로부터 경과 된 시간을 기록한다. 참고 :이 문제는 보통 4 ~ 5 분 소요됩니다. 4. 이미지 분석 및 데이터 처리 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 선택을ROI 등의 반응 챔버의 내부입니다. 모든 화상 ROI의 평균 형광 강도 값을 획득. 주 : 이것은 원시 형광 강도 트레이스이다. 각 반응 챔버의 내부 주위의 관심 영역을 선택하는 데 사용하는 시계열 분석 – 시계열 분석 및 투자 수익 (ROI) 관리자 플러그인을 사용하여 ImageJ에이 작업을 수행합니다. 각 반응 챔버의 내부에 해당하는 영역 "AutoROIProperties을"설정 "을 클릭에 추가"를 확인하고, 각 실을 선택합니다. 참고 :이 단계는 또한 형광 실 주위에 ROI를 그릴 타원 도구를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 이 투자 수익 (ROI)의 크기는 일반적으로 100X의 목적으로 본 10 μm의 직경 챔버를위한 30 X 30 픽셀 타원에 해당합니다. 투자 수익 (ROI) 관리자에서 모든 로아를 선택합니다. 전체 이미지 스택을 통해 각각의 투자 수익 (ROI)의 형광 강도의 평균을 결정하기 위해 "다중 측정"기능을 사용합니다. 참고 : 역 이름 플러그인ckReg 필요한 경우, 화상의 스택을 정렬하기 위해 사용될 수있다. 실험에서 모든 챔버에 대한 원시 형광 강도 트레이스를 획득 한 후, 모든 흔적 걸쳐 실험 간 평균 복용, 개별 원시 트레이스로부터 평균을 뺌으로써 반응의 결정적 요소를 결정한다. 이와 분석 IGOR 또는 MS Excel과 같은 사용 데이터 분석 소프트웨어. 참고 :이 노이즈를 제공하는 각 반응 챔버에 대한 추적합니다. 셀 (25)로부터 유래 된 유전자 발현을 분석 노이즈 사용한 것과 동일한 방법을 이용하여 상기 반응 챔버들에서 유전자 발현을 분석 노이즈.

Representative Results

이 미세 가공 된 플랫폼의 뚜렷한 이점은 독립적으로 반응 CFP들 (도 2a)를 한정하기 위해 작동되는 제어 가능한 엘라스토머 「제어 밸브」의 애플리케이션이다. 장치가 작동 될 때, 멤브레인 챔버가 반응 챔버 (도 2c)의 배열로 형광 시약을 제한하는데 유리 슬라이드에 대해 가압된다. 챔버 확실 실험 기간을 통해 반응을 제한하는지 확인하기 위해, 기본적인 시험 FRAP (광표백 후 형광 복구) (37)을 실시 하였다. 형광 물질 (AF 555) 장치에인가하고, 제어 밸브 작동시켰다 현미경의 셔터 조리개를 사용하여 (그림 2D)를 하나의 잘 형광 물질은 격리 된 구속 개별적으로 광 퇴색. 어두운되었고, 제어 밸브가 20 분을 감압 될 때까지 밝기가 회복되지 않았다 잘 선택60; 후, 유리 챔버를 해제. 이 시험은 이러한 반응 챔버는 실험 기간 동안 잘 밀봉 남아 있는지 확인. 최적의 조건에서 (예 : GFP 또는 루시 페라 제)를 쉽게 시각화 단백질을 발현 CFP들 반응이 장치에 적용되는 몇 분 이내에 검출 단백질을 표현한다. 반응의 수명 동안, 반응 챔버의 내부 및 외부에서 단백질 합성이 묘화되고 각각의 챔버 (도 3a)에서 형광 강도를 측정하는 단위로 정량. 형광 강도는, 단백질 농도에 대응하여, 각각의 반응 챔버 (도 3d)에 대한 시간에 걸쳐 매핑 될 수있다. 유전자 발현은 모든 분자 단계 (바인딩 합성, 분해, 단백질 DNA 등) (20)의 변동 (잡음)를 소개 본질적으로 확률 적 과정이다. 노이즈 생물학의 한 지점에 초점을 맞추고유전자 회로 (41)의 소음 시험하는 값. 무 세포 시스템에서의 발현은 발현의 분자 장치 및 반응 용기의 경계를 정의하는 표면들 사이의 상호 작용에서 발생하는 외부 잡음 효과를 가질 것이다. 무 세포 반응이 더 작은 반응 챔버에 갇혀 이러한 외부 효과는 가능성이 더 뚜렷해질 것이다. 다중 밀폐 CFP들 반응의 시간 경과 이미징을 수행하는 기능은 셀룰러 시스템 (25)에 대해보고 된 방법에 직접적으로 유사한 방식으로 한정 무 세포 시스템에서의 잡음 구조체 (크기 및 역학)의 신중한 분석을 가능하게한다.도 3c를 및 3D 약, 약 300 FL의 양에 대응하는, PDMS 반응 챔버 10 μm의 직경에 비해, 15 μL의 웰 부피 표준 384- 웰 마이크로 플레이트에서 T7 프로모터 항시 적 GFP 발현의 시간 과정을 보여 일곱 순서작은 크기의. 10 μm의 반응 챔버에서의 단백질 발현 비율의 변동은 이러한 세포에서 본 접근, 웰 – 플레이트의 측정에 비해 훨씬 높다. 장치상에서 수행 다중 반응은 마이크로 플레이트 리더 고원은 종종 반응 부피 42,43 내의 리소스의 제한에 의해 야기되는 것으로 가정 형광의 신속한 증가가 (도 3b)에 일괄 적으로 수행 CFP들 반응과 유사한 반응 속도를 나타낸다 . 이 결정 성장 거동은 변동하지만, 모든 반응 챔버들에 걸쳐, 그리고 실험간에 대체로 일관 – 실험을 통해 챔버들 사이 트레이스를 평균화함으로써, 결정적 경향 반응 (도 4a) 만 노이즈 성분을 떠나는 추적 값으로부터 감산 될 수있다 .도 4b는 결정 성, 과도 성분의 제거 (상단 후 GFP 발현 노이즈를 도시),도 4a는 10 μm의 반응 챔버에 대응하는 흔적을 표시하는 동안 잡음 (하단)의 자기 상관 (autocorrelation). 자기 상관 추적의 제로 래그 타임이 변동으로서, 노이즈의 크기를 제공하는 동안 자기 상관 추적의 절반 시간의 분포는 소음의 주파수 의존성을 제공한다. 도 1의 무 세포 단백질 합성 반응은 유전자 발현 노이즈를 측정 할 목적 femtoliter 규모 반응 챔버 내에 한정되어있다. 상업적 무 세포 단백질 발현 시스템에서 반응물 내부 PDMS 반응 챔버 GFP 구조적 익스프레스 한정하기 위해 사용된다. 이러한 챔버들의 배열은 단백질 발현 및 유전자 발현 잡음을 특성화하기 위해 저속 형광 현미경으로 가시화 될 수있다. 형광 강도 오시간이 지남에 따라 각 반응 챔버는 개별 추적으로 그릴 수있다 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 밀봉 femtoliter 규모의 챔버와 두 겹의 미세 유체 장치의 2. 제조. (A) 레이아웃 및 장치 층의 분해도. 두 장치는 PDMS 층과 유리 커버 슬립으로 구성된다. 유리와 컨트롤 밸브 사이에 밀봉 층 PDMS 막는 반응 챔버를 보유하고있다. PDMS 반응 챔버 (B) SEM 이미지. 내경 ~ 10㎛이다. 장치에서의 입력 채널 (C) 회로도. 무 세포 단백질 합성 (CFP들) 시약은 반응 채널을 통해 흐른다. 물은 컨트롤에 가압밸브 실 (37)을 밀봉, 유리 슬라이드에 대해 반응 챔버를 압축. 참고 문헌에서 재현. 화학의 왕립 학회의 허가 37. (D) 형광 복구 잘 FITC 챔버를 나타냅니다 사용하여 하나의에 (FRAP) 시험을 광표백 후 외부 환경에 대해 잘 밀봉한다. 형광은 챔버 (상단 이미지)에서 체포됐다 단일 우물 (아래 이미지) 광 퇴색되었다. 형광 복구가 제어 밸브가 해제 될 때까지 광 퇴색 실에서 볼 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 밀폐 셀 무료 반응 그림 3. EGFP 식입니다. (A) 밀봉 반응 C의 형광 이미지 반응에서 선택한 시점에서 hambers. 단백질 생산은 반응 챔버 내부에서 상기 메인 채널의 챔버 안팎을 알 수있다. (B) EGFP는 T7 중합 효소 프로모터와 터미네이터 강한 리보좀 결합 부위 (RBS)를 제공, Pet3a 벡터에 클로닝 하였다. (C) 마이크로 플레이트 판독기에서 수행되는 벌크 무 세포 반응에서 EGFP의 구성 적 발현 표준화 형광 측정. CFP들 반응은 통상 신속 '정상 상태'로 감속하기 전에 형광 단백질을 생산 – 이것은 리소스 제한 (43)와 관련된다. 검은 색 대시 평균 추적을 나타냅니다. (D) 여러 실험을 통해 51 반응 챔버에서 읽기 (51) 원시 형광 강도 추적의 표준화 형광. 블랙 대시 단백질 발현의 결정적 요소를 도시 여러 실험을 통해 평균 트레이스를 나타낸다./52616/52616fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4. 개별 노이즈 추적 및 셀룰러와 무 세포 시스템의 노이즈 자기 상관. (A) 오스틴에서 등., GFP 발현 (위)와 박테리아 (25) 생활의 추적 GFP 생산에서 얻은 정규화 된 자기 상관 함수 (아래)에서 2006 년 소음. 맥밀란 출판사 (주)의 허가에 의해 재판 : [자연] (25). (권 439), 저작권 (2006). 미세 유체 장치의 반응 챔버에서 추적 (B) GFP 발현 (위)과 무 세포 시스템에서 GFP의 생산에서 얻은 정규화 된 자기 상관 함수 (아래)에 소음. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

Discussion

세포에서 유전자 발현 인해 작은 볼륨 및 셀룰러 중요한 반응물의 적은 카피 수 본질적 잡음이다. 소음 생물학은 종종 소스, 처리 및 유전자 회로 및 네트워크 (44)를 제어하는 분자의 인구, 농도, 위치 또는 상태의 변동의 생물학적 영향에 초점을 맞추고있다. 본 작업의 대부분은 세포 내에서 유전자의 자연 네트워크 컨텍스트 내 유전자 회로의 노이즈를 볼 수있는 장점을 갖는다 셀룰러 시스템에서 수행되었다. 그러나, 무 세포 시스템은 셀룰러 시스템에서 피할 수없는 외부 교란 효과 (18)없이 개별 유전자 회로의 본질적인 특성의 변동을 허용한다. 잡음 분석은 유전자 기능을 어떻게 구성되어 회로 및 방법에 중요한 물리적 통찰을 제공 할 수 있고, 음극 (25) 및 양극을 특성화하기 위해 셀룰러 시스템에 사용 된 <suP> (27) 자동 조절, 외부 및 45, 46 파열 식 노이즈 (18), 그리고 전사의 본질 기여. 여기서 우리는 더 한정하고 47, 48 군집이없이 극한 단백질 발현 노이즈에 미치는 역할을 이해하기 위해, 반응기의 크기 및 반응 개시 시간의 동시 제어를 가능 마이크로 유체 소자에서 무 세포 발현 시스템의 연구를 설명 살아있는 세포와 관련된 합병증.

디자인의 기능을 활성화 키 femtoliter 볼륨 (마이크론 스케일) 트랩 PDMS에 엘라스토머 「제어 밸브」멤브레인, 무 세포 단백질 발현 시스템의 반응물을 한정 사용, 반응 챔버의 배열의 통합이다 반응 개시에 대한 잘 정의 된, "0 시간"에 반응물 (도 1). 이 컨트롤은 단백질 합성에 관여하는 반응의 반응 속도가 foll 수 있습니다높은 정밀도와 실시간으로 빚. 실험 간 가변성은 가급적 최소화되도록 이와 같이, 무 세포 반응물을 관리하는 것이 중요하다. 이러한 제어 기술은 우리는 이전에 살아있는 세포에서 유전자 발현을 평가하는데 사용되는 유사하게하여 무 세포 유전학적인 회로 노이즈 구조를 평가할 수있다.

CFP들 시스템에 사용되는 반응물 사이클 동결 – 해동에 민감 할 수있는 바와 같이, 상기 반응물은 얼음 위에서 해동 보내는 시간을 차가운 반응물을 유지하고 최소화하는 것이 중요하다. 주기적으로 시간이 지남에 따라 발현 수준의 변화를 식별하기 위해 대량으로 CFP들 시스템의 발현을 테스트하는 것이 좋다 – 이것은 에펜 도르프 튜브에서 10 내지 15 μL 반응에서 수행, 또는 마이크로 플레이트 리더와 같은 장치 일 수있다 다중을 수행하는 반응 속도를 캡처하는 시간이 지남에 따라 읽습니다. 낮은 표현 리터 문제를 해결할 때 모든 실험 반응물의 연령과 해동 시간을 주목하는 것은 도움이 될 것입니다evels. CFP들 시약 조립시 게다가, 그것이 완전히 조립과 얼음에서 제거되면 반응을 시작한다는 것을 명심해야한다. 일관성 "0 시간"을 유지하기 위해, DNA 입력의 최종 첨가 후 CFP들 반응 시작 다음 시간을 기록하고, 배양 장치에 가능한 한 빨리 상기 반응을 적용하는 것이 도움이된다. 이 과정은 약 4-5 분 소요, 형광 아직 반응 챔버 내에서 볼 수 없습니다해야합니다. 이 컨트롤은 반응 곡선의 성장 부를 시각화 가능 시간이 최대화되는 것을 보장한다.

단말기 CFP들 반응을 실행하기 전에, 품질 관리 시험 챔버로부터 누설이없는 검증하기 위해 실행하는 것이 바람직하다. FRAP 시험 장치에 형광 물질을 도포하고, 웰을 완전히 탈색 될 때까지 개별 웰을 노출시킴으로써 (도 2d에서와 같이) 수행 될 수있다. 챔버가있는 경우실의 벽과 내부와 외부 공간 사이의 뚜렷한 대조가 있어야한다 – 어떤 복구는 물론 내부에 볼 수 없어야한다, 잘 밀봉. 형광 복구 명백한 또는 반응 챔버의 벽이 잘 정의되지 않은 경우, 제어 밸브의 압력은 증가되어야하거나 장치는 유리 슬라이드로부터의 누설이나 박리를 검사한다.

이 프로토콜은 상업 E.에서 CFP들 시약 테스트되었습니다 다른 강력한 CFP들 시스템이 사용될 수 있지만 (25 μL로 조정) 대장균 무 세포 단백질 발현 키트. 이 시약 비용이 실험에서 제한 인자 일 때 도움이 될 수있어서, 반응에 적용시 25 μL보다 훨씬 낮은 볼륨을 사용하는 것이 가능하다. 따라서이 장치 suitab 아니다 – 반응물이 장치에 첨가하고, 반응 챔버가 밀봉되면, 디 – 구동 제어 밸브없이 용액에 반응물을 추가 할 수 없다반응 과정 중에 시약의 첨가를 필요로 반응 르. 평가되지 않은이 기간 후에 탈수 및 건조 장치의 효과 -이 장치는 또한, CFP들 3 시간보다 오래 실행할 수 반응을 관찰에 최적화되지 않는다. 긴 반응 시간이 요구되는 경우, 이러한 효과는, 또는 습도 챔버를 사용하여, 증발을 방지하기 위해 소자 밀봉 배양 온도를 변경함으로써 완화 될 수있다. 이러한 챔버 벽 (49, 50) 또는 다공성 멤브레인 층의 포함에 나노 다공성 구조로서 장치 설계에 대한 수정은, 시약 교환을 허용하고, 따라서, 반응 시간의 척도를 길게 할 수 몇 가지 방법을 나타낸다.

균일 한 볼륨의 미세 반응 구획 구획 벽 쪽 "반응"으로 실험과 조사를 위해 매우 적합 일관된 치수를 유지하는 가치가있다. 사용 방법과는 달리이러한 반응은 작은 숫자로 평가되어야한다, 기술을 N-마이크로 제조, 실험시 차원의 유연성을 제공하지 않습니다. 그러나, 이들의 반응 챔버에 대한 제어 가능한 설계는 시간 경과 현미경에 매우 적합하고, 협착의 높은 처리량에있어서 조명 보완 될 수있다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 ga needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100x oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
sharp 23 ga needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexafluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version
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Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).
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