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Bioengenharia

सेल मुक्त जीवविज्ञान के लिए sealable Femtoliter चैंबर सारणियों

Published: March 11, 2015
doi:
10.3791/52616
, , , , , ,
1Bredesen Center,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Nanophase Materials Sciences,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Materials Science and Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Abstract

सेल मुक्त प्रणालियों जटिल संसाधन के बंटवारे से अलग जैविक प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट नेटवर्क की जांच के लिए एक लचीला मंच प्रदान (जैसे, वैश्विक जीन अभिव्यक्ति, कोशिका विभाजन) जीवित कोशिकाओं के भीतर का सामना करना पड़ा। हालांकि, पारंपरिक वृहद पैमाने थोक रिएक्टरों में इस्तेमाल ऐसी प्रणालियों, अक्सर उनके रहने सूक्ष्म पैमाने समकक्षों की विशेषता गतिशील व्यवहार और क्षमता का प्रदर्शन करने में विफल। प्रतिक्रिया गतिशीलता पर आंतरिक कोशिका संरचना और पैमाने के प्रभाव को समझना जटिल जीन नेटवर्क को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम संलग्न आणविक प्रणाली का लचीला लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, जबकि सेलुलर पैमाने खंडों में सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं किनारा कि एक microfabricated डिवाइस की रिपोर्ट। इस बहुपरती पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) डिवाइस (खुले और बंद) actuated किया जा सकता है जो एक elastomeric झिल्ली पर femtoliter पैमाने पर प्रतिक्रिया कक्षों में शामिल है। Actuated करते हैं, कक्षों सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (CFPS) प्रतिक्रियाओं सीमितसमय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग समय के साथ प्रतिक्रिया कैनेटीक्स के दृश्य के लिए अनुमति देता है, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त। यहाँ हम इस डिवाइस CFPS जीन सर्किट को चिह्नित करने के लिए, जिससे सेलुलर प्रणालियों में इस्तेमाल शोर जीव विज्ञान तकनीक के उपयोग को सक्षम करने, सेलुलर सिस्टम विशेषताएँ इस्तेमाल उन लोगों के लिए सीधे अनुरूप है कि एक तरह से CFPS प्रतिक्रियाओं का शोर संरचना को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शन कैसे और सेल से मुक्त वातावरण के साथ उनकी बातचीत।

Introduction

सेल मुक्त प्रणालियों जीवित कोशिकाओं के अध्ययन में अपरिहार्य हैं कि इस तरह के रखरखाव, विभाजन, और उत्परिवर्तन के रूप में उलझी कारकों से मुक्त जैविक प्रतिक्रियाओं को देखने के लिए एक सरल और लचीला मंच प्रदान करते हैं। इस तरह के दृष्टिकोण झिल्ली प्रोटीन 1 के लक्षण, प्रोटीन बातचीत दो की जांच कर रही है, और अनुवाद 3-7 के बुनियादी पहलुओं का अन्वेषण सहित सेलुलर प्रणाली का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हाल ही में सेल मुक्त सिस्टम सिंथेटिक जीव विज्ञान 8-10 के लिए व्यवहार्य प्लेटफॉर्म के रूप में एक पैर जमाने हासिल करने के लिए शुरू कर दिया है। इस तरह के दृष्टिकोण से अपील है कि वे जीवित कोशिकाओं में प्रतिक्रिया गतिशीलता को प्रभावित करता है कि संसाधन साझा करने और 'बाह्य शोर' से सिंथेटिक जीव विज्ञान को मुक्त करता है। हालांकि सवालों सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं एम्बेडेड रहे हैं, जिसमें भौतिक वातावरण प्रतिक्रिया की प्रगति और परिणाम को प्रभावित करता है के रूप में कैसे रहते हैं। सेल मुक्त प्रतिक्रिया वातावरण – विशेष रूप से सीमित वातावरणसेल-प्रासंगिक संस्करणों दृष्टिकोण है कि पिता – खराब विशेषता रहते हैं। सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (CFPS) लीटर पैमाने पर प्रतिक्रिया संस्करणों से 11 माइक्रोलीटर की एक सीमा के पार बराबर कैनेटीक्स का प्रदर्शन 'पैमाने मुक्त,' होने के रूप में की पारंपरिक सोचा है। बहरहाल, सेलुलर पैमाने संस्करणों के लिए सीमित प्रतिक्रियाओं काफी प्रोटीन अभिव्यक्ति की दरों में 12 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।

स्टोकेस्टिक सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं की प्रकृति – विशेष रूप से संस्करणों femtoliter नीचे जाना भी इन पद्धतियों के दृष्टिकोण के रूप में या – विशेष महत्व का हो सकता है। जीन अभिव्यक्ति में शोर बहुत छोटे सेल की मात्रा और घटकों के उच्च घनत्व के रूप में कारावास से प्रभावित एक संपत्ति महत्वपूर्ण अणुओं के कई मजबूर है बहुत कम जनसंख्या के स्तर को – उदाहरण के लिए, एक एक FL मात्रा भीतर Escherichia कोलाई सीमीत के रूप में कई 4300 के रूप में अलग polypeptides के तहत कई सौ अलग प्रमोटरों एक की inducible नियंत्रण3। यह निहित शोर कीमोटैक्सिस 14 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय प्रेरणा शक्ति के रूप में शामिल किया गया है, सक्रिय प्रतिकृति और विलंबता 15, सेल और lysogeny 16,17 के बीच λ फेज निर्णय, और क्षमता के बीच बेसिलस subtillus निर्णय के बीच एचआईवी निर्णय और sporulation 17। सेल मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान तो सेलुलर जीन सर्किट और नेटवर्क के stochastic गुणों का पता लगाने, और विशेष तकनीकी लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए इन कार्यों में हेरफेर करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है दोनों। सेलुलर सिस्टम के शोर व्यवहार 18-27 अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, वहीं विशेष रूप से सेलुलर पैमाने पर, सेल मुक्त प्रणालियों 8 के मौलिक शोर व्यवहार के छोटे अन्वेषण किया गया है।

यहाँ हम सेल मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान में स्टोकेस्टिक प्रभावों के अध्ययन के लिए एक मंच प्रस्तुत करते हैं। इस microfabricated मंच femtoliter पैमाने पर प्रतिक्रिया सी होता हैजल्दी से खुले में (और चैम्बर के बाहर मुक्त प्रसार) और राज्यों बंद (कक्ष के भीतर ही सीमित अभिकारकों) के बीच से परिवर्तित हो सकता है, जो hambers। बंद राज्य में, हम एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (CFPS) अभिकारकों सीमित है, और समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 28 (चित्रा 1) का उपयोग जीन की अभिव्यक्ति का पालन करें। हम कोशिकाओं 25 विशेषताएँ इस्तेमाल उन लोगों के लिए सीधे अनुरूप एक तरीके में जीन अभिव्यक्ति में स्टोकेस्टिक उतार चढ़ाव की संरचना को मापने के द्वारा इस सेल से मुक्त वातावरण विशेषताएँ। सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं सीमित के लिए गैर-microfabrication के तरीकों vesicles और liposomes 29-32, पानी में तेल emulsions के 12, और झरझरा मीडिया 33 में शामिल हैं। इन तरीकों सीमित संस्करणों 34 के आकार के वितरण पर नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं हालांकि, जबकि, microfabrication के तरीकों भी nanoscale पर कसकर निर्दिष्ट आयामों के साथ अत्यधिक replicable सुविधाओं पैदा करते हैं।इसके अलावा, इन कठोर संरचनाओं आसानी से वाष्पीकरण या बाहरी वातावरण में परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील होने के बिना समय के साथ लगाया जा सकता है। जल्दी से प्रतिक्रिया (समय शून्य) शुरू किया गया था, जब समय का स्पष्ट असाइनमेंट उलझी प्रतिक्रिया दीक्षा निम्नलिखित प्रतिक्रिया कक्षों को सील नहीं कर सकते पिछले काम 8,35 में इस्तेमाल microfabricated कंटेनर डिजाइन। यहाँ प्रस्तुत विधि का प्रयोग, केवल 4-5 मिनट जिससे एक अच्छी तरह से परिभाषित "समय शून्य" प्रदान करने, दीक्षा और डिवाइस पर प्रतिक्रिया के दृश्य के बीच की जरूरत है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल fabricating और ऑप्टिकल लिथोग्राफी, विधानसभा डिवाइस, डिवाइस का परीक्षण, और छवि विश्लेषण के लिए तरीकों सहित, इस उपकरण के परीक्षण के लिए विधियों का वर्णन।

Protocol

डिवाइस मास्टर्स के 1. ऑप्टिकल लिथोग्राफी कम से कम 1 घंटे के लिए ~ 250 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर साफ सिलिकॉन वेफर्स निर्जलीकरण। नोट: यह उपयोगकर्ता त्रुटि के मामले में, एक मास्टर की तैयारी है जब एक से अधिक वेफर उपयोग करने के लिए अच्छा अभ्यास है। Photoresist के aliquots तैयार करें। का उपयोग करते हुए एक अनुपात मंदक के रूप में सु-8 पतले: 2015 SU-8 photoresist और 2 में एस यू-8 2015 photoresist की एक कमजोर पड़ने दोनों की aliquots तैयार करें। नोट: लगभग photoresist की 1 मिलीलीटर स्पिन कोटिंग एक वेफर के लिए आवश्यक है। इन स्वामी के उत्पादन के लिए तीन मुखौटा पैटर्न तैयार करें। एक patterning के झिल्ली चैनल और अन्य patterning प्रतिक्रिया कक्षों: झिल्ली मास्टर के लिए, दो मास्क तैयार करते हैं। नियंत्रण वाल्व मास्टर के लिए, केवल एक मुखौटा पैटर्न तैयार करते हैं। नोट: मुखौटा patterning सहित Lithographic तकनीकों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, डिवाइस डिजाइन के एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए आईटीओ और Okazaki, 2000 36 देखें Fowlkes और खनक, 2013 को देखने 37। झिल्ली मास्टर तैयार करें स्पिन कोट 2: 45 सेकंड के लिए 1,000 rpm पर वेफर्स पर एक र -8 2015 photoresist के कमजोर पड़ने। 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर शीतल सेंकना वेफर्स। एक संपर्क aligner का उपयोग, 10 सेकंड के लिए झिल्ली चैनल पैटर्न के साथ वेफर्स का पर्दाफाश, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए एक के बाद जोखिम सेंकना प्रदर्शन करते हैं। एक मिनट के लिए SU-8 डेवलपर में वेफर्स का विकास करना, या photoresist के अवशेषों को हटा दिया गया है जब तक। ऊपर से नीचे तक चलती है, isopropanol के साथ वेफर कुल्ला। फिर ऊपर से नीचे तक आगे बढ़ नाइट्रोजन के साथ सूखी वेफर,। 4 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना वेफर्स। 45 सेकंड के लिए 2000 rpm पर एक र -8 कमजोर पड़ने: स्पिन कोट 2 के साथ फिर से वेफर्स नमूनों। शीतल सेंकना 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए वेफर्स नमूनों। संपर्क aligner का उपयोग, कक्ष प्रतिक्रिया पैटर्न के साथ नमूनों वेफर्स संरेखित, और 10 सेकंड के लिए बेनकाब। 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए बाद जोखिम सेंकना प्रदर्शन करते हैं। कदम 1.4.3 में वर्णित के रूप में वेफर्स का विकास करना। 4 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर वेफर्स, सेंकना वेफर्स के विकास और सूखने के बाद। नोट: वेफर्स पिछले चरण में इस्तेमाल किया गया था कि एक ही डेवलपर में विकसित किया जा सकता है। नियंत्रण वाल्व मास्टर तैयार करें स्पिन कोट 45 सेकंड के लिए 2000 rpm पर साफ वेफर्स पर SU-8 photoresist undiluted। छह मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर शीतल सेंकना वेफर। एक संपर्क aligner का उपयोग, 10 सेकंड के लिए नियंत्रण वाल्व पैटर्न के साथ वेफर्स बेनकाब। छह मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक के बाद जोखिम सेंकना प्रदर्शन करते हैं। 2 मिनट के लिए SU-8 डेवलपर में वेफर्स का विकास करना, या छाछ निकाल दिया जाता है जब तक। ऊपर से नीचे तक चलती है, isopropanol के साथ कुल्ला। 4 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन और सेंकना के साथ सूखी वेफर। 2. PDMS डिवाइस निर्माण वाष्प जमाव के माध्यम से 0.2 मिलीलीटर trimethylchlorosilane ~ साथ सभी स्वामी Silanize। जल्दी silanizing एजेंट की कुछ बूंदों के साथ आरटी पर एक कंटेनर में मास्टर लगा देना। नोट:। अन्य silanizing प्रोटोकॉल स्वीकार्य हो सकता है 38 यदि प्रदर्शन किया properlवाई, PDMS दूर करने के लिए आसान हो जाएगा। इसी तरह बहुपरत वाल्व में प्रदर्शन किया गया है के रूप में 39 डिजाइन, इस उपकरण की झिल्ली और नियंत्रण वाल्व परतों दोनों के लिए अलग-अलग अनुपात में एक वाणिज्यिक पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) का आधार है और इलाज एजेंट मिलाएं। 1 और 5: आधार के एक अनुपात: 20 उपयोग झिल्ली और नियंत्रण वाल्व molds के लिए इलाज के एजेंट, क्रमशः। झिल्ली आचारण के लिए, इलाज के एजेंट के 0.5 जी के साथ बेस के 10 ग्राम मिश्रण। नोट: यह मात्रा झिल्ली मास्टर पर स्पिन लेपित किया जाएगा। : 1 के अनुपात नियंत्रण वाल्व आचारण के लिए, एक 5 में आधार है और इलाज एजेंट मिश्रण। नियंत्रण वाल्व गुरु धारण करने के लिए इस्तेमाल किया कंटेनर पर निर्भर करेगा नियंत्रण वाल्व मोल्ड करने के लिए आवश्यक PDMS की राशि; मास्टर PDMS की ~ 1 सेमी के साथ लेपित है कि इस तरह के कंटेनर भरें। अच्छी तरह से कोई हवाई बुलबुले दिखाई दे रहे हैं जब तक दोनों एक निर्वात चैम्बर में तैयारी, और de-गैस उन्हें PDMS मिश्रण। एक गर्मी प्रतिरोधी में नियंत्रण वाल्व मास्टर रखेंकंटेनर, एक गिलास पकवान के रूप में इस तरह के। 1 के अनुपात मास्टर पर PDMS, और de-गैस कंटेनर एक दूसरी बार: सावधानी से 5 डालना। नियंत्रण वाल्व PDMS कंटेनर de-मार डाला जा रहा है, वहीं स्पिन कोट 20: ध्यान से हवा बुलबुला गठन को कम करने की झिल्ली मास्टर पर PDMS मिश्रण गिरने से झिल्ली गुरु पर 1 के अनुपात PDMS, तो स्पिन कोटिंग मास्टर 1000 rpm पर 45 सेकंड के लिए। आंशिक रूप से झिल्ली मास्टर के लिए 6 मिनट और नियंत्रण वाल्व मास्टर के लिए 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में दोनों स्वामी का इलाज। नोट: आंशिक रूप से ठीक हो, जब PDMS उसके रूप धारण करना चाहिए, लेकिन सामग्री थोड़ा कठिन हो जाएगा। PDMS अभी तक ठीक नहीं किया जाता है तो जब दबाया सामग्री अपने रूप धारण जब तक, एक समय में कुछ ही मिनट की वेतन वृद्धि में फिर से सेंकना। दूर धीरे नए साँचे छीलने, नियंत्रण वाल्व गुरु से आयताकार PDMS के नए नए साँचे काटें। एक 0.75 मिमी छेद पंच का उपयोग ढाला घटक के माध्यम से इनलेट छेद पंच। नोट: छेद एक 23 गेज blun डालने से साफ किया जा सकता हैयदि आवश्यक हो तो टी टिप सुई, और मोल्ड बाहरी, सिलोफ़न टेप से साफ किया जा सकता है। झिल्ली गुरु पर प्रतिक्रिया कक्षों का पता लगाने प्रतिक्रिया कक्ष झिल्ली की सुविधाओं के साथ नियंत्रण वाल्व ढालना घटक संरेखित और झिल्ली मास्टर के शीर्ष पर सीधे नियंत्रण वाल्व घटक स्थान के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना। डिवाइस के नीचे बाएँ कोने में नियंत्रण वाल्व इनलेट ओरिएंट, और प्रतिक्रिया कक्षों और झिल्ली मास्टर के चैनल आयताकार नियंत्रण वाल्व के अंदर दिखाई दे रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं। 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गठबंधन ढालना घटकों बनाओ। नोट: झिल्ली और नियंत्रण वाल्व के नए नए साँचे अब एक साथ सील, और एक मोल्ड के रूप में चालाकी से किया जाएगा। झिल्ली छेदना के रूप में नहीं तो बहुत धीरे दूर मास्टर से मोल्ड छीलने, दूर झिल्ली गुरु से स्तरित PDMS ढालना काटें। इनलेट पंच और एक 0.75 मिमी छेद पंच का उपयोग सेल निकालने इनपुट के लिए छेद आउटलेट। दोनों परतों के माध्यम से छेद पंच,कदम 2.6 में वर्णित के रूप में और एक ही रास्ते में उन्हें साफ। एक उपपादन-मिलकर प्लाज्मा क्लीनर, प्लाज्मा इलाज दोनों मोल्ड (झिल्ली ऊपर की ओर) और 20 सेकंड के लिए 10.5 डब्ल्यू पर एक नं 0 गिलास coverslip का उपयोग करना। इसके तत्काल बाद प्लाज्मा क्लीनर से coverslip और मोल्ड हटाने के लिए और कांच और मोल्ड के बीच हवा जेब को कम से कम करने के प्रयास में, कांच की ओर, झिल्ली पक्ष के घटकों परत। झिल्ली इनपुट चैनल पर सीधे प्रेस मत करो, या झिल्ली यह मुश्किल अभिकारकों के साथ चैनल को भरने के लिए कर रही है, कांच के लिए पानी रखना हो सकता है। कांच की परत को तोड़ने से बचने के लिए इकट्ठे उपकरणों से निपटने जब विशेष ध्यान रखना। डिवाइस उच्च बढ़ाई तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग गिलास coverslip के माध्यम से imaged किया जाना चाहिए के रूप में पतली कांच coverslips का प्रयोग करें – कांच भी मोटी है, तो डिवाइस सुविधाओं दिखाई नहीं हो सकता। अंत में, 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पूरा उपकरणों का इलाज। 3. प्रायोगिक सेटअप के लिएआर सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया 1 घंटे के लिए विआयनीकृत पानी में उबलते द्वारा एक युक्ति हाइड्रेट। नोट: पूरी तरह से हाइड्रेटेड जब डिवाइस एक बादल उपस्थिति होनी चाहिए। इस उपकरण में भी यह हाइड्रेट करने के क्रम में आरटी पर बाँझ पानी में हे / एन छोड़ा जा सकता है। एक ऊष्मायन चैम्बर के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, 30 डिग्री सेल्सियस परिवेश के तापमान की स्थापना की। नोट: यह तापमान ताकि अन्य प्रतिक्रियाओं के लिए अधिकतम तापमान 40 भिन्न हो सकते हैं, एक T7 प्रमोटर के साथ GFP की अभिव्यक्ति अनुकूलन करने के लिए चुना गया था। माउंट डिवाइस सिलोफ़न टेप के साथ मंच धारक माइक्रोस्कोप और स्थानीय जलयोजन बनाए रखने के लिए गीले टिश्यू पेपर के साथ इस उपकरण के किनारों को लपेटने के लिए। नियंत्रण वाल्व actuation और अभिकर्मक इनपुट के लिए नाइट्रोजन गैस के दबाव मिलाना दो उच्च परिशुद्धता बंद लूप वोल्टेज दबाव transducers का प्रयोग करें। नोट: अन्य अक्रिय गैसों में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि यह प्रोटोकॉल ही, कम शुद्धता नाइट्रोजन के साथ परीक्षण किया गया है। द्वारा पहली ट्रांसड्यूसर कनेक्टएक पट ढक्कन के साथ एक 4 मिलीलीटर कांच की शीशी में आयोजित एक पानी जलाशय के लिए 24 गेज PTFE ट्यूबिंग। एक 23 गेज कुंद टिप सुई द्वारा समाप्त एक दूसरे ट्यूब का उपयोग करते हुए नियंत्रण वाल्व इनलेट जलाशय से कनेक्ट करें। नोट: दोनों ट्यूबों दो तेज 23 गेज सुई के साथ जलाशय पट घुसना। एक पुरुष-से-पुरुष Luer-लोक कनेक्टर से जुड़ा 24 गेज PTFE ट्यूबिंग द्वारा दूसरे ट्रांसड्यूसर कनेक्ट करें। प्रत्येक डिवाइस के लिए व्यक्तिगत रूप से इकट्ठा किया है जो एक और 23 गेज कुंद टिप सुई, साथ टयूबिंग से जुड़े एक Luer-लोक 23 गेज सुई के लिए इस संलग्न। यह सुई झिल्ली प्रतिक्रिया चैनल को जोड़ता है; प्रतिक्रिया चैनल और इनपुट अभिकर्मकों से पानी फ्लश करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं। एक सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का प्रयोग, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, बर्फ पर CFPS प्रतिक्रिया के लिए घटकों को इकट्ठा। बर्फ पर CFPS अभिकर्मकों पकड़े बिताए समय को कम करने और विधानसभा के बाद तुरंत डिवाइस में प्रतिक्रिया जगह। नोट: इस डिवाइस के लिए किया गया हैएक व्यावसायिक ई के साथ इस्तेमाल किया कोलाई प्रोटीन अभिव्यक्ति किट और अनिवार्यता से GFP व्यक्त एक प्लाज्मिड निकाल सकते हैं। कुल प्रतिक्रिया मात्रा 25 μl करने के लिए बढ़ाया गया था – यह वांछित है, तो अभिकारकों के लिए एक भी कम मात्रा का उपयोग करना संभव हो सकता है। CFPS अभिकर्मकों चक्र पिघलना फ्रीज करने के लिए संवेदनशील हो जाते हैं, यह प्रयोग करने से पहले उचित मात्रा में अभिकर्मकों की aliquots बनाने के लिए उपयोगी हो सकता है। अन्य अभिकर्मकों प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जा सकता है, लेकिन प्रतिक्रिया पूरी तरह से डिवाइस के लिए लागू किया जा रहा से पहले इकट्ठा किया जाना चाहिए। पिछले डीएनए इनपुट जोड़ने, प्रतिक्रिया इकट्ठा। नोट: एक Eppendorf ट्यूब में इकट्ठे एक बार बर्फ पर आयोजित यदि नहीं, तो CFPS प्रतिक्रिया शुरू हो जाएगा। इस समस्या निवारण में लगातार प्रयोगों के बीच timescale, और सहायता रखेंगे – समय डिवाइस के लिए अभिकर्मकों लागू करते हैं और प्रयोग भिन्न हो सकते हैं शुरू करने के लिए ले जाया के बाद से प्रतिक्रिया इकट्ठा किया और मिलाया जाता है एक बार, यह एक टाइमर शुरू करने के लिए उपयोगी है। का प्रयोगचरण 3.4.2 में वर्णित ट्यूबिंग और सुई कनेक्टर, 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ट्यूब में इकट्ठे प्रतिक्रिया वापस ले लें। प्रतिक्रिया कक्ष इनलेट में कुंद टिप सुई डालें। सिरिंज से सुई कनेक्टर को अलग करें और प्रतिक्रिया कक्ष ट्रांसड्यूसर के लिए इस्तेमाल पुरुष-से-पुरुष कनेक्टर को देते हैं। चैनल को भरने के लिए CFPS अभिकारकों के लिए दबाव (<10 साई) को लागू करें। प्रतिक्रिया भर जाता है जब सुई निकालें। नियंत्रण वाल्व इनलेट में अन्य ट्रांसड्यूसर से कुंद ट्यूब डालें। अभी तक नियंत्रण वाल्व दबाव मत करो। मंच पर मुहिम शुरू की युक्ति रखें। Brightfield इमेजिंग का उपयोग करना, एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ प्रतिक्रिया कक्षों का पता लगाने। उकसाना 20 साई को नियंत्रण वाल्व ट्रांसड्यूसर दबाव से नियंत्रण वाल्व; नियंत्रण वाल्व actuated है जब झिल्ली में एक दृश्य परिवर्तन स्पष्ट हो जाएगा। प्रतिक्रिया कक्षों का पैंदा पर ध्यान दें। छवि अधिग्रहण शुरू; प्रतिदीप्ति में वृद्धि Wयह संभावना प्रतिक्रिया के प्रारंभिक दौर में स्पष्ट नहीं किया जाएगा, हालांकि बीमार, इंटीरियर में और प्रतिक्रिया कक्षों के बाहर चारों ओर दिखाई दे सकता है। प्रतिक्रिया एक स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति तक पहुँच जाता है जब तक हर 1-3 मिनट छवियों पर कब्जा। एक स्वचालित रूप से ध्यान केंद्रित कर मंच उपलब्ध नहीं है, तो संक्षेप में छवियों को ले जाया जा रहा करने से पहले प्रत्येक छवि refocus। नोट: कुछ photobleaching से घटित होगा, वहीं वजह photobleaching के सापेक्ष प्रतिदीप्ति पर प्रभाव के रूप में लंबे समय photobleaching की दर से जाना जाता है के लिए जिम्मेदार हो सकता है। इस photobleaching दर समय की अवधि में निरंतर photobleaching के लिए इस तरह के GFP की एक ज्ञात एकाग्रता या एक फ्लोरोफोरे मिश्रण के रूप में एक फ्लोरोसेंट मानक, उजागर द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। अधिग्रहीत पहली छवि को प्रतिक्रिया विधानसभा से गुजरे समय रिकॉर्ड। नोट: यह आम तौर पर 4-5 मिनट लगते हैं। 4. छवि विश्लेषण और डाटा प्रोसेसिंग ऐसे ImageJ के रूप में एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, का चयनएक रॉय के रूप में प्रतिक्रिया कक्षों के इंटीरियर। सभी छवियों के लिए रॉय के मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य मोल। नोट: यह कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने के लिए है। प्रत्येक कक्ष प्रतिक्रिया के इंटीरियर के आसपास हित के क्षेत्रों का चयन करने के लिए उपयोग समय सीरीज विश्लेषक – समय श्रृंखला विश्लेषक और आरओआई प्रबंधक plugins का उपयोग ImageJ में इस कार्य को पूरा करें। , प्रत्येक कक्ष प्रतिक्रिया के इंटीरियर से मेल खाती है, जो एक क्षेत्र के लिए "AutoROIProperties" सेट "पर क्लिक करें पर जोड़ें" की जांच, और प्रत्येक कक्ष का चयन करें। नोट: इस कदम भी फ्लोरोसेंट कक्ष के आसपास एक रॉय आकर्षित करने के लिए दीर्घवृत्त उपकरण का उपयोग किया जा सकता है। इस आरओआई आकार आमतौर पर एक 100X उद्देश्य के साथ देखा एक 10 माइक्रोन व्यास कक्ष के लिए एक 30 x 30 पिक्सेल दीर्घवृत्त से मेल खाती है। आरओआई प्रबंधक में सभी ROIs हाइलाइट करें। पूरी छवि ढेर के माध्यम से प्रत्येक रॉय के प्रतिदीप्ति तीव्रता मतलब निर्धारित करने के लिए "मल्टी उपाय" समारोह का उपयोग करें। नोट: स्टेडियम नामक एक प्लगइनckReg यदि आवश्यक हो, छवि ढेर संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक प्रयोग में सभी कक्षों के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता निशान प्राप्त करने के बाद, सभी निशान के पार एक अंतर-प्रयोगात्मक औसत ले रही है, और व्यक्तिगत कच्चे निशान से औसत घटाकर की प्रतिक्रिया का नियतात्मक घटक निर्धारित करते हैं। इस तरह के विश्लेषण के लिए इगोर या एमएस एक्सेल के रूप में उपयोग डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर। नोट: यह शोर प्रदान करता है प्रत्येक कक्ष प्रतिक्रिया के लिए बताते हैं। कोशिकाओं 25 से निकाली गई जीन अभिव्यक्ति शोर का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक ही तरीके का उपयोग कर इन प्रतिक्रिया कक्षों से जीन अभिव्यक्ति शोर का विश्लेषण करें।

Representative Results

इस microfabricated मंच के विशिष्ट लाभ स्वतंत्र रूप CFPS प्रतिक्रियाओं (2A चित्रा) सीमित करने के क्रम में actuated है जो चलाया हुआ elastomeric "नियंत्रण वाल्व" के आवेदन में है। डिवाइस actuated है, जब झिल्ली कक्षों प्रतिक्रिया कक्षों (चित्रा -2) की एक सरणी में फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों सीमित करने के लिए गिलास स्लाइड के खिलाफ दबाया जाता है। कक्षों मज़बूती से प्रयोग की अवधि के माध्यम से प्रतिक्रिया सीमित है कि सत्यापित करने के लिए, एक बुनियादी FRAP टेस्ट (photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) 37 आयोजित किया गया। एक fluorophore (वायुसेना 555) डिवाइस के लिए लागू किया गया था, और नियंत्रण वाल्व actuated गया था; माइक्रोस्कोप के शटर एपर्चर का उपयोग करते हुए, एक (चित्रा 2 डी) एकल में अच्छी तरह से फ्लोरोफोरे पृथक किया गया सीमित और व्यक्तिगत रूप से photobleached। अंधेरा हो गया और नियंत्रण वाल्व 20 मिनट depressurized किया गया था जब तक चमक में ठीक नहीं था अच्छी तरह से चुना60, बाद में, कांच से चैम्बर रिहा। इस परीक्षा में इन प्रतिक्रिया कक्षों प्रयोग की अवधि के लिए अच्छी तरह से सील रहते हैं कि पुष्टि करता है। इष्टतम स्थितियों में, (जैसे GFP या luciferase के रूप में) एक आसानी से कल्पना प्रोटीन व्यक्त एक CFPS प्रतिक्रिया इस डिवाइस के लिए लागू किया जा रहा है के कुछ ही मिनटों के भीतर से detectable प्रोटीन व्यक्त करता है। प्रतिक्रिया के जीवनकाल में, प्रतिक्रिया कक्षों की आंतरिक और बाहरी में प्रोटीन संश्लेषण imaged है और प्रत्येक कक्ष (चित्रा 3 ए) के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता की इकाइयों को मापने के द्वारा मात्रा। प्रतिदीप्ति तीव्रता, प्रोटीन एकाग्रता के लिए इसी प्रत्येक प्रतिक्रिया कक्ष (चित्रा 3 डी) के लिए समय के साथ मैप किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति हर आणविक कदम (बंधन संश्लेषण, ह्रास, प्रोटीन डीएनए, आदि) के 20 में उतार-चढ़ाव (शोर) का परिचय है कि एक स्वाभाविक स्टोकेस्टिक प्रक्रिया है। शोर जीव विज्ञान की एक शाखा पर केंद्रितजीन सर्किट शोर 41 के प्रमाण के मूल्य। सेल मुक्त प्रणालियों में अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति की आणविक मशीनरी और प्रतिक्रिया वाहिकाओं की सीमाओं को परिभाषित है कि सतहों के बीच बातचीत से उठता है कि बाह्य शोर प्रभाव पड़ेगा। सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं भी छोटे प्रतिक्रिया कक्षों में सीमित कर रहे हैं के रूप में इन बाह्य प्रभाव होने की संभावना अधिक स्पष्ट हो जाएगा। कई सीमित CFPS प्रतिक्रियाओं के समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता है तो सेलुलर सिस्टम 25 के लिए सूचित किया गया है कि तरीकों के लिए सीधे अनुरूप एक तरह से सीमित सेल मुक्त प्रणालियों में शोर संरचना (परिमाण और गतिशीलता) के सावधान विश्लेषण में सक्षम बनाता है। चित्रा -3 सी और 3 डी के बारे में, के बारे में केवल 300 फ्लोरिडा के संस्करणों के लिए इसी PDMS प्रतिक्रिया कक्षों 10 माइक्रोन व्यास में में की तुलना में 15 μl की एक अच्छी तरह से मात्रा के साथ एक मानक 384 अच्छी तरह से microplate में एक T7 प्रमोटर से विधान GFP अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम दिखाने सात आदेशकम परिमाण की है। 10 माइक्रोन प्रतिक्रिया कक्षों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की दरों में परिवर्तनशीलता कोशिकाओं में देखा उन के पास आ, अच्छी तरह से थाली माप की तुलना में बहुत अधिक है। डिवाइस पर प्रदर्शन मल्टिप्लेक्स प्रतिक्रियाओं एक microplate पाठक पठारों, अक्सर प्रतिक्रिया मात्रा 42,43 भीतर संसाधन सीमा की वजह से हो ग्रहण करने के लिए जो प्रतिदीप्ति में एक तेज वृद्धि हुई है, जहां (3B चित्रा), पर थोक में प्रदर्शन CFPS प्रतिक्रियाओं के समान कैनेटीक्स का प्रदर्शन । इस नियतात्मक विकास व्यवहार, अस्थिर, हालांकि सभी प्रतिक्रिया कक्षों के पार, और प्रयोगों के बीच आम तौर पर संगत है – प्रयोगों भर में कक्षों के बीच निशान के औसत से, नियतात्मक प्रवृत्ति प्रतिक्रिया (चित्रा -4 ए) का ही शोर घटकों छोड़ रहा है, का पता लगाने के मूल्यों से घटाया जा सकता है । 4B चित्रा नियतात्मक, क्षणिक घटक को हटाने के (शीर्ष के बाद GFP अभिव्यक्ति शोर से पता चलता है), और चित्रा -4 ए 10 माइक्रोन प्रतिक्रिया कक्षों में इसी निशान से पता चलता है, जबकि शोर (नीचे) के autocorrelation,। autocorrelation निशान के शून्य अंतराल समय विचरण के रूप में, शोर के परिमाण देता है, जबकि autocorrelation निशान के आधे समय में वितरण शोर की आवृत्ति निर्भरता देता है। चित्रा 1. सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण अभिकारकों जीन अभिव्यक्ति शोर मापने के उद्देश्य से femtoliter पैमाने प्रतिक्रिया कक्षों में ही सीमित हैं। एक वाणिज्यिक सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली से reactants अंदर PDMS प्रतिक्रिया कक्षों GFP अनिवार्यता से एक्सप्रेस सीमित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन कक्षों की एक सरणी प्रोटीन अभिव्यक्ति और जीन अभिव्यक्ति शोर चिह्नित करने के क्रम में समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ देखे जा सकते हैं। प्रतिदीप्ति तीव्रता ओसमय के साथ प्रत्येक कक्ष प्रतिक्रिया एक व्यक्ति का पता लगाने के रूप में साजिश रची जा सकता है एफ। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा sealable femtoliter पैमाने पर कक्षों के साथ दो परत microfluidic युक्ति 2. निर्माण। (ए) लेआउट और डिवाइस परतों को देखते हुए विस्फोट हो गया। डिवाइस दो PDMS परतों और एक गिलास coverslip से बना है। कांच और नियंत्रण वाल्व परतों के बीच सील PDMS झिल्ली, प्रतिक्रिया कक्षों रखती है। PDMS प्रतिक्रिया कक्ष (बी) SEM छवि। आंतरिक व्यास 10 माइक्रोन है। डिवाइस में इनपुट चैनल (सी) योजनाबद्ध। सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (CFPS) अभिकर्मकों प्रतिक्रिया चैनल के माध्यम से भेजा जाता है। जल नियंत्रण में दबाव हैवाल्व कक्षों 37 सील, गिलास स्लाइड के खिलाफ प्रतिक्रिया कक्षों सेक करने के लिए। रेफरी से reproduced। रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ 37। (डी) प्रतिदीप्ति वसूली अच्छी तरह से FITC के कक्ष को इंगित करता है का उपयोग करते हुए एक एकल पर (FRAP) के परीक्षण के बाद photobleaching बाहरी वातावरण के खिलाफ अच्छी तरह से बंद है। फ्लोरोफोरे कक्षों (ऊपरी छवि) में कब्जा कर लिया था और एक भी अच्छी तरह से (कम छवि) photobleached गया था। कोई प्रतिदीप्ति वसूली नियंत्रण वाल्व जारी किया गया था जब तक photobleached कक्ष में देखा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। सीमित सेल मुक्त प्रतिक्रिया में चित्रा 3. EGFP अभिव्यक्ति। (ए) सील प्रतिक्रिया सी के प्रतिदीप्ति छवियों प्रतिक्रिया में चुना समय बिंदुओं पर hambers। प्रोटीन के उत्पादन प्रतिक्रिया कक्षों के अंदर और मुख्य चैनल में कक्षों के बाहर दोनों को देखा जा सकता है। (बी) EGFP के एक T7 पोलीमरेज़ प्रमोटर और टर्मिनेटर और एक मजबूत राइबोसोम बाध्यकारी साइट (आरबीएस) उपलब्ध कराने, एक Pet3a वेक्टर में क्लोन किया गया था। (सी) एक microplate रीडर में प्रदर्शन एक थोक सेल मुक्त प्रतिक्रिया में EGFP के विधान अभिव्यक्ति की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति माप। CFPS प्रतिक्रियाओं आमतौर पर जल्दी से एक 'स्थिर अवस्था' प्रतिदीप्ति को धीमा करने से पहले प्रोटीन का उत्पादन – इस संसाधन सीमा 43 के साथ जुड़ा हुआ है। काला डैश औसत ट्रेस संकेत मिलता है। (डी) कई प्रयोगों से अधिक 51 प्रतिक्रिया कक्षों से पढ़ने के 51 कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता निशान की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति। काला डैश प्रोटीन अभिव्यक्ति की नियतात्मक घटक को वर्णन है, जो कई प्रयोगों से अधिक औसत ट्रेस संकेत मिलता है।/52616/52616fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4. व्यक्तिगत शोर निशान और एक सेलुलर और सेल मुक्त प्रणाली के शोर Autocorrelation। (ए) ऑस्टिन से एट अल।, GFP अभिव्यक्ति (ऊपर) और बैक्टीरिया 25 में रहने वाले पर नज़र रखने GFP के उत्पादन से प्राप्त कर लिया सामान्यीकृत autocorrelation कार्य (नीचे) में 2006 शोर। मैकमिलन पब्लिशर्स लिमिटेड से अनुमति के द्वारा पुनर्प्रकाशित: [प्रकृति] 25 (। वॉल्यूम 439), कॉपीराइट (2006)। Microfluidic युक्ति प्रतिक्रिया कक्षों में ट्रैक (बी) GFP अभिव्यक्ति (ऊपर) और सेल मुक्त प्रणाली में GFP उत्पादन से प्राप्त कर लिया सामान्यीकृत autocorrelation कार्य (नीचे) में शोर,। कृपया यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

Discussion

कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के कारण छोटे सेलुलर मात्रा और महत्वपूर्ण अभिकारकों की कम प्रतिलिपि संख्या स्वाभाविक शोर है। शोर जीव विज्ञान अक्सर सूत्रों का कहना है, प्रसंस्करण, और जीन सर्किट और नेटवर्क 44 को नियंत्रित कि अणुओं की आबादी, सांद्रता, स्थिति, या राज्यों में उतार-चढ़ाव के जैविक परिणामों पर केंद्रित है। इस काम के विशाल बहुमत कोशिका के भीतर आनुवंशिक नेटवर्क के प्राकृतिक संदर्भ में एक जीन सर्किट के शोर को देखने का लाभ दिया है, जो सेलुलर प्रणाली, में प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, सेल मुक्त प्रणालियों सेलुलर सिस्टम में टाला नहीं जा सकता है कि confounding बाह्य प्रभाव 18 बिना एक व्यक्ति के जीन सर्किट के आंतरिक उतार चढ़ाव के लक्षण वर्णन अनुमति देते हैं। शोर का विश्लेषण कैसे वे समारोह आनुवंशिक सर्किट संरचित कर रहे हैं और कैसे में महत्वपूर्ण शारीरिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, और नकारात्मक 25 और सकारात्मक चिह्नित करने के लिए सेलुलर प्रणालियों में इस्तेमाल किया गया है <suपी> 27 autoregulation, बाह्य और 45,46 फोड़ अभिव्यक्ति शोर 18, और ट्रांसक्रिप्शनल करने के लिए आंतरिक योगदान। यहाँ हम बेहतर कारावास और 47,48 भीड़ के बिना आंतरिक प्रोटीन अभिव्यक्ति शोर पर है कि भूमिकाओं को समझने के क्रम में, रिएक्टर आकार और प्रतिक्रिया दीक्षा टाइम्स के एक साथ नियंत्रण सक्षम है कि microfluidic उपकरणों में एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के अध्ययन का वर्णन जीवित कोशिकाओं के साथ जुड़े जटिलताओं।

डिजाइन की सुविधा को सक्षम करने कुंजी femtoliter मात्रा (माइक्रोन पैमाने पर) कि जाल PDMS में एक elastomeric "नियंत्रण वाल्व" झिल्ली के साथ, एक सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के अभिकारकों सीमित के लिए इस्तेमाल प्रतिक्रिया कक्षों की सरणियों का एकीकरण है प्रतिक्रिया दीक्षा के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित किया, "समय शून्य" में अभिकारकों (चित्रा 1)। यह नियंत्रण प्रोटीन संश्लेषण में शामिल प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स foll की अनुमति देता हैउच्च परिशुद्धता के साथ वास्तविक समय में होता था। अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता जितना संभव हो कम से कम है तो यह है कि इस तरह के रूप में, यह सेल मुक्त अभिकारकों के प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण है। इस पर नियंत्रण के लिए हमें तकनीक पहले से जीवित कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल के अनुरूप है कि एक तरह से सेल मुक्त आनुवंशिक सर्किट के शोर संरचना का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।

CFPS प्रणालियों में इस्तेमाल किया अभिकारकों चक्र पिघलना फ्रीज करने के लिए संवेदनशील हो सकते हैं, यह अभिकारकों बर्फ पर विगलन खर्च ठंड अभिकारकों रखने के लिए और कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह समय-समय पर समय के साथ अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन की पहचान करने के क्रम में थोक में CFPS प्रणाली की अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए अच्छा अभ्यास है – यह एक Eppendorf ट्यूब में एक 10-15 μl प्रतिक्रिया में किया है, या एक microplate रीडर की तरह एक डिवाइस में किया जा सकता है , कई प्रदर्शन करती है जो प्रतिक्रिया कैनेटीक्स कब्जा करने के लिए समय के साथ पढ़ता है। कम अभिव्यक्ति एल समस्या निवारण जब हर प्रयोग के लिए अभिकारकों की उम्र और पिघलना टाइम्स टिप्पण में मदद मिलेगीevels। CFPS अभिकर्मकों कोडांतरण जब इसके अलावा, यह है कि यह पूरी तरह से इकट्ठे और बर्फ से निकाले जाने के बाद प्रतिक्रिया शुरू हो जाएगा कि नोट करना महत्वपूर्ण है। एक सुसंगत "समय शून्य" बनाए रखने के क्रम में, यह डीएनए इनपुट के अंतिम इसके बाद CFPS प्रतिक्रिया की दीक्षा निम्नलिखित समय रिकॉर्ड करने के लिए, और incubated डिवाइस के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्रतिक्रिया लागू करने के लिए उपयोगी है। इस प्रक्रिया के बारे में 4-5 मिनट के लिए ले जाना चाहिए, और प्रतिदीप्ति अभी तक प्रतिक्रिया कक्षों के भीतर दिखाई नहीं करना चाहिए। यह नियंत्रण प्रतिक्रिया की अवस्था के विकास के हिस्से कल्पना करने के लिए उपलब्ध समय अधिकतम है कि आश्वासन दिया।

डिवाइस पर CFPS प्रतिक्रियाओं को चलाने से पहले, यह गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण कक्षों से कोई रिसाव नहीं है सत्यापित करने के लिए चलाने के लिए उचित है। एक FRAP परीक्षण उपकरण के लिए एक फ्लोरोफोरे लागू करने और अच्छी तरह से पूरी तरह से प्रक्षालित है जब तक एक व्यक्ति को अच्छी तरह से उजागर करके (चित्रा 2 डी के रूप में) का प्रदर्शन किया जा सकता है। कक्षों रहे हैंडिब्बे की दीवारों और आंतरिक और बाहरी रिक्त स्थान के बीच एक विपरीत होना चाहिए – कोई वसूली अच्छी तरह से अंदर दिखाई जानी चाहिए, अच्छी तरह से सील कर दिया। प्रतिदीप्ति वसूली स्पष्ट है या प्रतिक्रिया कक्ष की दीवारों में अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं, नियंत्रण वाल्व पर दबाव बढ़ाया जाना चाहिए या डिवाइस गिलास स्लाइड से रिसाव या delamination के लिए जाँच की जानी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक ई से CFPS अभिकर्मकों के साथ परीक्षण किया गया है अन्य मजबूत CFPS प्रणालियों में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि (25 μl करने के लिए बढ़ाया) कोलाई सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति किट,। यह अभिकर्मक लागत प्रयोगों में एक सीमित कारक है जब सहायक हो सकता है, जो डिवाइस, के लिए प्रतिक्रियाओं को लागू करने के लिए जब 25 μl की तुलना में काफी कम मात्रा में उपयोग करने के लिए संभव है। इस प्रकार इस डिवाइस suitab नहीं है – अभिकारकों डिवाइस के लिए जोड़ रहे हैं और प्रतिक्रिया कक्षों सील कर रहे हैं एक बार, यह डे-actuating नियंत्रण वाल्व के बिना समाधान के लिए अभिकारकों जोड़ने के लिए संभव नहीं हैप्रतिक्रिया के दौरान अभिकर्मकों के अलावा आवश्यकता होती है जो प्रतिक्रियाओं के लिए LE। मूल्यांकन नहीं किया गया इस समय अवधि के बाद निर्जलीकरण और डिवाइस के सूखने के प्रभाव – यह युक्ति भी CFPS तीन घंटा से अधिक समय तक चला सकते हैं जो प्रतिक्रियाओं के अवलोकन के लिए अनुकूल नहीं है। अब प्रतिक्रिया समय वांछित हैं, तो इन प्रभावों, या एक आर्द्रता चैम्बर का उपयोग करके, वाष्पीकरण को रोकने के लिए इस उपकरण सील ऊष्मायन तापमान बदलकर कम किया जा सकता है। ऐसे कक्ष की दीवारों 49,50 या एक झरझरा झिल्ली परत के शामिल किए जाने में nanoporous संरचनाओं के रूप में डिवाइस डिजाइन करने के लिए संशोधन, अभिकर्मक विनिमय की अनुमति है और इस प्रकार की प्रतिक्रिया समयमानों को लंबा कर सकता है जो कुछ विधियों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

वर्दी मात्रा की microfabricated प्रतिक्रिया डिब्बों डिब्बे दीवारों के साथ "पक्ष प्रतिक्रियाओं" में प्रयोगों और जांच के लिए अत्यधिक उपयुक्त भर में लगातार आयाम बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। का उपयोग करने के तरीकों के विपरीत कोईइन प्रतिक्रियाओं छोटे संख्या में मूल्यांकन किया जाना चाहिए, तकनीक एन microfabricated, और प्रयोगों के दौरान आयामी लचीलापन प्रदान नहीं करते हैं। हालांकि, इन प्रतिक्रिया कक्षों के लिए चलाया डिजाइन समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए अत्यधिक उपयुक्त है, और प्रसूति के एक उच्च throughput विधि करने के लिए एक रोशन पूरक हो सकता है।

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 ga needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100x oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
sharp 23 ga needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexafluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version
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Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).
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