JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

מערכים רבים סגר Femtoliter הלשכה לביולוגיה ללא סלולארי

Published: March 11, 2015
doi:
10.3791/52616
, , , , , ,
1Bredesen Center,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Nanophase Materials Sciences,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Materials Science and Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Abstract

מערכות תא ללא לספק פלטפורמה גמישה לחיטוט רשתות ספציפיות של תגובות ביולוגיות מבודדות משיתוף המשאבים המורכב (למשל, ביטוי גנים הגלובליים, חלוקת תא) נתקל בתוך תאי חיים. עם זאת, מערכות כאלה, המשמשים בכורים בתפזורת מאקרו בקנה מידה מקובלים, לעתים קרובות אינן מצליחות להציג התנהגויות דינמיות ויעילות אופייניות לעמיתי מיקרו בקנה מידת החיים שלהם. הבנת ההשפעה של מבנה תא פנימי וקנה מידה על דינמיקת תגובה היא קריטית להבנת רשתות גנים מורכבות. כאן אנו מדווחים מכשיר microfabricated שמגביל את תגובות תא ללא בכמויות בקנה מידה סלולריות תוך מתן אפשרות לאפיון גמיש של המערכת המולקולרית הסגורה. פולי זה רב שכבתי (dimethylsiloxane) מכשיר (PDMS) מכיל תאי תגובת femtoliter בקנה מידה על קרום אלסטומרי שניתן actuated (פתוח וסגור). כאשר מונעים, התאים להגביל סינתזה תגובות Cell חלבון-חינם (CFPS)להביע חלבון פלואורסצנטי, המאפשר להדמיה של קינטיקה התגובה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות. כאן אנו מדגימים כיצד מכשיר זה יכול לשמש כדי למדוד את מבנה הרעש של תגובות CFPS באופן שהוא ישירות מקביל לאלה המשמשים לאפיון מערכות סלולריות, ובכך מאפשר את השימוש בטכניקות ביולוגיה רעש בשימוש במערכות סלולריות לאפיין מעגלי גן CFPS ו יחסי הגומלין שלהם עם הסביבה ללא תא.

Introduction

מערכות תא ללא להציע פלטפורמה פשוטה וגמישה לצפייה תגובות ביולוגיות חופשיים מגורמים שמסבך כגון כושר, החלוקה, ומוטציה שהם בלתי נמנעים במחקר של תאי חיים. גישות כאלה כבר מועסקים ללמוד מערכות סלולריות כוללים האפיון של חלבונים בממברנה 1, חיטוט של אינטראקציות חלבון 2, והחקירה של היבטים בסיסיים של תרגום 3-7. לאחרונה מערכות תא ללא החלו להשיג דריסת רגל כפלטפורמות קיימא עבור ביולוגיה סינתטית 8-10. הערעור של גישות כאלה הוא שהם ישחררו את הביולוגיה סינתטית משיתוף המשאבים ו" הרעש חיצוני "המשפיע על דינמיקת תגובה בתאים חיים. עם זאת נותרו שאלות לגבי איך הסביבה הפיסית שבה תגובות תא ללא מוטבעות משפיעה על ההתקדמות והתוצאה של התגובה. סביבות תגובת תא ללא – environm במיוחד מוגבלמציג המתקרב כרכי תא-רלוונטי – יישאר מאופיין בצורה גרועה. Cell החלבון-חינם הסינתזה (CFPS) היא מחשבה מקובלת של כ" scale-חופשי, 'מציג קינטיקה שווה על פני מגוון של microliter לכרכי תגובת ליטר בקנה מידה 11. עם זאת, תגובות כליאת לכרכים בקנה מידה סלולריות הוכחו להשפיע באופן משמעותי שיעורי ביטוי חלבון 12.

הטבע סטוכסטיים של תגובות תא ללא – במיוחד כאשר גישת מערכות אלה או אפילו ללכת מתחת femtoliter כרכים – עשוי להיות בעלת חשיבות מיוחדת. רעש בביטוי גנים הוא רכוש המושפע במידה רבה על ידי כליאה כאמצעי אחסון נייד קטן וצפיפות גבוהה של רכיבים לכפות רב של המולקולות החשובות לרמות אוכלוסייה נמוכות מאוד – למשל, גבולות coli Escherichia בתוך fl 1 נפח מתחת לכמה ש4,300 פוליפפטידים שונים השליטה מושרה של כמה מאה יזמים שונים 13. רעש טבוע זו היה מעורב ככוח מניע מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל chemotaxis 14, החלטת HIV בין שכפול הפעיל ו -15 חביון, החלטת הפאג λ בין תמוגה וlysogeny 16,17, והחלטת subtillus Bacillus בין הסמכות ונִבִיגָה 17. ביולוגיה סינתטית תא ללא לאחר מכן מספקת גם הזדמנות לחקור את המאפיינים סטוכסטיים של מעגלי גן סלולריים ורשתות, ולטפל התנהגויות אלה כדי להשיג את מטרות טכנולוגיות ספציפיות. בעוד רעש ההתנהגות של מערכות סלולריות נחקרה היטב 18-27, חל חקר קטן של רעש ההתנהגות הבסיסית של מערכות תא ללא 8, במיוחד בקנה המידה הסלולרית.

כאן אנו מציגים פלטפורמה לחקר השפעות סטוכסטיים בביולוגיה סינתטית מחוץ לתא. פלטפורמת microfabricated זה מכילה femtoliter בקנה מידת התגובה גhambers אשר עשוי יועבר במהירות בין (דיפוזיה חופשית בתוך ומחוץ לתא) הפתוחה וסגורים (מגיבים מוגבלים בתוך התא) המדינות. במצב הסגור, נגביל מגיבים Cell-חינם חלבון הסינתזה (CFPS) לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ובצעו את ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות 28 (איור 1). אנו מאפיינים את הסביבה ללא תא הזה על ידי מדידת המבנה של התנודות סטוכסטיים בביטוי גנים באופן ישיר דומה לאלה המשמשים לאפיון תאים 25. שיטות לא microfabrication לכליאת תגובות תא ללא כוללות שלפוחית ​​ויפוזומים 29-32, אמולסיות מים בשמן 12, ותקשורת נקבובית 33. עם זאת, בעוד ששיטות אלה יכולים לספק שליטה על התפלגות הגודל של הכרכים מוגבלים 34, שיטות microfabrication ליצור תכונות שכפול מאוד עם ממדים שצוינו בחוזקה, אפילו בקנה המידה ננומטרי.יתר על כן, ניתן לעקוב אחר מבנים הנוקשים אלה בקלות לאורך זמן מבלי להיות חשוף לאידוי או שינויים בסביבה החיצונית. עיצובי מיכל microfabricated משמשים ב8,35 עבודה קודמות לא יכול לאטום במהירות תאי התגובה הבאה ייזום תגובה, שמסבך את המשימה ברורה של הזמן שבו תגובת יזם (זמן אפס). תוך שימוש בשיטה שהוצגה כאן, רק 4-5 דקות יש צורך בין הייזום ויזואליזציה של התגובה על המכשיר, מתן ובכך מוגדר היטב "זמן אפס". הפרוטוקולים הבאים מתארים את השיטות לבודה ובדיקה במכשיר זה, ובכלל זה ליתוגרפיה אופטית, הרכבה מכשיר, בדיקת מכשיר, ושיטות לניתוח תמונה.

Protocol

1. ליתוגרפיה אופטית של מאסטרים התקן ליבש פרוסות סיליקון נקיות על צלחת חמה ב ~ 250 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. הערה: זה תרגול טוב להשתמש רקיק אחד או יותר בעת הכנת אב, במקרה של טעות משתמש. הכן aliquots photoresist. הכן aliquots של שני photoresist SU-8 שנת 2015, ודילול של SU-8 photoresist 2015 ב2: 1 יחס באמצעות SU-8 דק כמדללים. הערה: כ 1 מיליליטר של photoresist נחוץ לרקיק אחד ציפוי ספין. הכן שלושה דפוסי מסכה להפקת אדונים אלה. למאסטר ממברנה, להכין שתי מסכות: דפוסים אחד ערוץ הקרום ודפוסים האחרים תאי התגובה. לאדון הבקרה Valve, להכין רק אחד דפוס מסכה. הערה: לפרטים נוספים על טכניקות ליתוגרפי, כוללים דפוסי מסכה, לראות איטו וOkazaki, 2000. 36 ראו פוקס וקולייר, 2013 לתיאור מפורט יותר של עיצוב מכשיר 37. הכן את Master ממברנה ספין מעיל 2: 1 SU-8 דילול 2,015 photoresist על פרוסות ב 1000 סל"ד במשך 45 שניות. הוופלים לאפות רכים על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. שימוש aligner קשר, לחשוף הוופלים עם דפוס ערוץ קרום למשך 10 שניות, ולבצע לאפות לאחר חשיפה למשך 2 דקות על 95 מעלות צלזיוס. לפתח הוופלים בSU-8 מפתח דקות 1, או עד ששאריות photoresist יוסרו. יש לשטוף את הרקיק עם isopropanol, נע מלמעלה למטה. רקיק יבש עם חנקן, נע שוב מלמעלה עד למטה. הוופלים אופים בחום של 180 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. ספין מעיל בדוגמת הוופלים שוב עם 2: 1 דילול SU-8 ב2,000 סל"ד במשך 45 שניות. לאפות רך בדוגמת הוופלים למשך 2 דקות על 95 מעלות צלזיוס. שימוש aligner קשר, ליישר הוופלים בדוגמת עם תא תגובת דפוס, ולחשוף במשך 10 שניות. בצע לאפות לאחר החשיפה למשך 2 דקות על 95 מעלות צלזיוס. לפתח הוופלים כמתואר בשלב 1.4.3. לאחר פיתוח וייבוש הוופלים, הוופלים אופים בחום של 180 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. הערה: הוופלים עשויים להתפתח באותו מפתח ששימש בשלב הקודם. הכן את שסתום בקרת הורים ספין מעיל חי SU-8 photoresist על גבי פרוסות נקיות ב 2000 סל"ד במשך 45 שניות. רקיק לאפות רך על 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. שימוש aligner קשר, לחשוף הוופלים עם דפוס שסתום בקרה במשך 10 שניות. בצע לאפות לאחר חשיפה על 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. לפתח הוופלים בSU-8 Developer למשך 2 דקות, או עד ששאריות מוסר. לשטוף עם isopropanol, נע מלמעלה למטה. רקיק יבש עם חנקן ואופה בחום של 180 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. 2. PDMS ייצור מכשיר Silanize כל המאסטרים עם ~ 0.2 מיליליטר trimethylchlorosilane באמצעות אדים בתצהיר. מהירות לתחום את האדון בכלי אטום בRT עם כמה טיפות סוכן silanizing של. הערה:. פרוטוקולי silanizing אחרים עשויים להיות מקובלים 38 אם properl בוצעy, PDMS יהיה קל להסיר. מערבבים פולי מסחריים (dimethylsiloxane) בסיס (PDMS) וסוכן ריפוי ביחסים שונים עבור שני שכבות שסתום הקרום ובקרה של המכשיר, כפי שהודגם בmultilayer שסתום דומה עיצובי 39. השתמש 20: 1 ו -5: 1 יחס של בסיס: סוכן ריפוי לתבניות שסתום קרום ובקרה, בהתאמה. לעובש הקרום, לערבב 10 גרם של בסיס עם 0.5 גרם של סוכן ריפוי. הערה: נפח זה יהיה ספין מצופה על אדון הקרום. לעובש שסתום הבקרה, לערבב את הבסיס וסוכן ריפוי ב5: 1. כמות PDMS הנחוץ כדי לעצב את שסתום הבקרה יהיה תלוי במכל משמש להחזיק את אב שסתום בקרה; למלא את המכל כך שההורים מצופה ~ 1 סנטימטר של PDMS. לערבב ביסודיות שני PDMS הכנות, ודה-גזם בתא ואקום עד אין בועות אוויר גלויות. מניחים את המאסטר שסתום בקרה בעמיד בחוםמיכל, כגון כלי זכוכית. יוצקים בזהירות 5: 1 PDMS יחס על ההורים, ודה-גז המכל בפעם שנייה. בעוד מיכל PDMS שסתום הבקרה מתבצע דה-גז, ספין-מעיל 20: PDMS היחס 1 על אדון הקרום על ידי השפיכה בזהירות את תערובת PDMS על המאסטר הקרום כדי למזער היווצרות בועת אוויר, ולאחר מכן האדון-ציפוי הספין ב 1000 סל"ד במשך 45 שניות. באופן חלקי לרפא שני האדונים בתנור על 80 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות לאדון הקרום ו -15 דקות לאדון שסתום בקרה. הערה: כאשר נרפא באופן חלקי, PDMS צריך להחזיק את צורתו, אבל את החומר יהיה מעט דביק. אם PDMS עדיין לא נרפא, לאפות שוב במרווחים של כמה דקות בכל פעם, עד שהחומר מחזיק צורתו כשלוחצים עליו. לחתוך PDMS תבניות מלבניות מאדון שסתום בקרה, קילוף התבניות משם בעדינות. לנקב חורים בכניסה לרכיב היצוק באמצעות אגרוף חור 0.75 מ"מ. הערה: החור ניתן לנקות על ידי החדרת blun 23 מדמחט t קצה, וחוץ העובש ניתן לנקות עם קלטת צלופן, במידת צורך. באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאתר את תאי תגובה על אדון הקרום, ליישר את רכיב עובש שסתום בקרה עם התכונות של קרום תא התגובה ולמקם את רכיב שסתום הבקרה ישירות על גבי אב הקרום. כוון את שסתום בקרת הכניסה לפינה השמאלית התחתונה של המכשיר, ולהבטיח שתאי התגובה והערוץ של אדון הקרום גלויים בתוך שסתום הבקרה המלבני. אופים את רכיבי עובש מיושרים על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הערה: תבניות שסתום הקרום ושליטה עכשיו תהיינה אטומות יחד, ומניפולציות כתבנית אחת. חותך את עובש PDMS שכבתי מאדון הקרום, לקלף העובש מהאדון מאוד בעדינות כדי שלא לנקב את הקרום. אגרוף כניסה ויציאת חורים לקלט תמצית תא באמצעות ניקוב חורים 0.75 מ"מ. לנקב חורים דרך שני השכבות,ולנקות אותם באותו אופן כמתואר בשלב 2.6. שימוש בשואב מצמידים אינדוקטיבי פלזמה, פינוק פלזמה הן העובש (כלפי מעלה קרום) וcoverslip זכוכית מס '0 ב10.5 W במשך 20 שניות. מייד להסיר את coverslip ועובש משואב הפלזמה ושכבת הרכיבים, צד קרום כלפי הזכוכית, מנסה למזער את כיסי אוויר בין הזכוכית והעובש. אל תלחצו ישירות על ערוץ קלט הקרום, או הקרום עשוי לחשל את הזכוכית, ולכן קשה למלא את הערוץ עם מגיבים. קח טיפול מיוחד בעת טיפול במכשירים התאספו כדי למנוע שבירת שכבת הזכוכית. השתמש coverslips זכוכית דק כמכשיר חייב להיות צילם באמצעות coverslip הזכוכית באמצעות מטרות נפט טבילה ההגדלה גבוהה – אם הזכוכית עבה מדי, תכונות המכשיר לא יכולות להיות גלויות. לבסוף, לרפא את ההתקנים הושלמו ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. 3. התקנה ניסיונית foתגובת סינתזה של חלבוני תא ללא r מימה מכשיר על ידי הרתחתו במים ללא יונים עבור שעה 1. הערה: מכשיר צריך להיות מראה מעונן כאשר התייבשות לחלוטין. מכשיר גם ניתן להשאיר O / N במים סטריליים בRT כדי ללחלח אותו. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם תא דגירה, לקבוע את טמפרטורת הסביבה עד 30 ° C. הערה: טמפרטורה זו נבחרה כדי לייעל את הביטוי של ה- GFP עם אמרגן T7, כך טמפרטורות אופטימליות לתגובות אחרות עשויות להיות שונות 40. מכשיר ההר למיקרוסקופ בעל במה עם קלטת צלופן ולעטוף קצוות של מכשיר בנייר טישו רטוב כדי לשמור על לחות מקומית. השתמש בשני מתמרי מתח לחץ לולאה סגורה ברמת דיוק גבוה כדי לווסת את לחץ גז חנקן לשסתום בקרת actuation וקלט מגיב. הערה: פרוטוקול זה נבדק רק עם חנקן נמוך טוהר, אם כי ניתן להשתמש בגזים אצילים אחרים. חבר את המתמר הראשון על ידיצינורות PTFE 24-מד למאגר מים שנערך בבקבוקון זכוכית 4 מיליליטר עם מכסה מחץ. חבר את המאגר לכניסת שסתום בקרה באמצעות צינור שני לסיום על ידי מחט קצה קהה 23 מד. הערה: שני הצינורות לחדור מחיצת המאגר עם שתי מחטי מד חדות 23. חבר את המתמר השני על ידי צינורות PTFE 24-מד מחוברים לזכר זכר למחבר Luer-Lok. לצרף את זה למחט 23 מד Luer-Lok שמחוברת בצינור עם עוד מחט קצה קהה 23 מד, שהתכנסה בנפרד עבור כל מכשיר. מחט זו מתחברת לערוץ תגובת קרום; להשתמש בו כדי לשטוף במים מערוץ התגובה וריאגנטים קלט. שימוש במערכת ביטוי חלבון תא ללא, להרכיב את הרכיבים לתגובת CFPS על קרח, על פי הוראות יצרן. למזער את המשך זמן החזקת חומרים כימיים CFPS על קרח ומניח את התגובה למכשיר מייד לאחר הרכבה. הערה: מכשיר זה כברבשימוש עם E. מסחרי coli לחלץ ערכת ביטוי חלבון ופלסמיד constitutively להביע GFP. סך נפח התגובה צומצם ל -25 μl – ייתכן שניתן להשתמש בנפח נמוך עוד יותר למגיבים, אם תרצה בכך. כריאגנטים CFPS נוטים להיות רגיש להפשרה להקפיא מחזורים, זה עשוי להיות מועיל לעשות aliquots של חומרים כימיים בנפח המתאים לפני הניסוי. ריאגנטים אחרים ניתן להוסיף לתערובת התגובה, אך התגובה חייבת להיות מורכב בשלמות לפני שפנה למכשיר. להרכיב את התגובה, הוספת קלט DNA האחרונה. הערה: ברגע שהתאסף בצינור Eppendorf, תגובת CFPS תתחיל אם אינו מוחזקת על קרח. מאז את הזמן שלוקח ליישם את ריאגנטים למכשיר ולהתחיל את הניסוי עשוי להשתנות, כדאי להתחיל טיימר פעם התגובה מורכבת ומעורבת – זה יהיה לשמור על לוח הזמנים בין ניסויים בקנה אחד, וסיוע בפתרון בעיות. שימוש במחבר צינור ומחט שתואר בשלב 3.4.2, למשוך את התגובה התאסף לתוך הצינור באמצעות מזרק 1 מיליליטר. הכנס את מחט הקצה הקהה לכניסת תא תגובה. ניתק את מחבר המחט מהמזרק ולצרף אותו למחבר זכר אל זכר המשמש למתמר תא תגובה. החל לחץ (<10 psi) למגיבי CFPS למלא את הערוץ. הסר את המחט כאשר התגובה מלאה. הכנס את הצינור הבוטה מהמתמר האחר לכניסת שסתום בקרה. אל חצים על שסתום הבקרה עדיין. מניחים את המכשיר רכוב על הבמה. שימוש בהדמית brightfield, לאתר את תאי תגובה עם מטרת נפט טבילה 100X. להניע את שסתום בקרה על ידי pressurizing מתמר שסתום בקרה עד 20 psi; שינוי נראה לעין בקרום יהיה ברור כאשר שסתום הבקרה מונע. להתמקד בתחתית של תאי התגובה. בגין רכישת התמונה; צמיחה בקרינה wחולה להיות גלוי בחלק הפנימי וסביב הצד החיצוני של תאי התגובה, למרות שזה סביר להניח כי לא יהיה ברור בשלבים המוקדמים של תגובת השלבים. צלם תמונות בכל דקות 1-3 עד התגובה מגיעה הקרינה מצב יציבה. אם הוא שלב באופן אוטומטי תוך התמקדות אינה זמין, ולמקד את כל תמונה לזמן קצר קודם לתמונות שנלקחו. הערה: בעוד כמה photobleaching יתרחש, ההשפעות על הקרינה היחסית בשל photobleaching עשויות להיות מטופלת כל עוד שיעור photobleaching ידוע. שיעור photobleaching זה עשוי להיות מוערך על ידי חשיפה סטנדרטי ניאון, כגון ריכוז ידוע של ה- GFP או תערובת fluorophore, לphotobleaching הקבוע על פני תקופה של זמן. רשום את הזמן שחלף ממכלול התגובה לתמונה הראשונה שנרכשה. הערה: זה בדרך כלל לוקח 4-5 דקות. 4. ניתוח תמונה ועיבוד נתונים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון ImageJ, בחרפנים של תאי התגובה כהחזר על השקעה. לרכוש את ערך עוצמת הקרינה הממוצע של ההחזר על ההשקעה עבור כל התמונות. הערה: זו עקבות עוצמת הקרינה גלם. לבצע משימה זו בImageJ באמצעות תוספי מנהל זמן סדרת Analyzer והחזר על השקעה – שימוש בזמן סדרת Analyzer לבחור אזורים של עניין סביב הפנים של כל תא תגובה. הגדר "AutoROIProperties" לאזור אשר תואם את הפנים של כל תא תגובה, לבדוק "הוסף בלחץ", ובחר בכל חדר. הערה: שלב זה גם ניתן לעשות זאת באמצעות כלי האליפסה לצייר את ההחזר על ההשקעה סביב תא הניאון. גודל ROI זה בדרך כלל מתאים לאליפסת 30 x 30 פיקסלים לחדר 10 מיקרומטר קוטר נצפה עם מטרת 100X. סמן את כל ROIs במנהל ההחזר על ההשקעה. השתמש בפונקציה "מדוד רב" כדי לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת של כל ROI דרך הערימה כל התמונה. הערה: תוסף בשם StackReg ניתן להשתמש כדי ליישר את ערימת התמונה, במידת צורך. לאחר שרכש את עקבות עוצמת הקרינה גלם לכל התאים בניסוי, לקבוע את הרכיב הדטרמיניסטי של התגובה על ידי לקיחת ממוצע בין-ניסיוני בכל העקבות, והפחתה הממוצעת מעקבות גלם בודדות. תוכנת ניתוח נתוני שימוש כגון איגור או MS Excel לניתוח זה. הערה: זה מספק רעש עקבות לכל תא תגובה. נתח את רעש ביטוי גנים מתאי תגובה אלה משתמשים באותן שיטות המשמשות לניתוח רעש ביטוי גנים שמקורם בתאים 25.

Representative Results

היתרון הבולט של פלטפורמת microfabricated זה ביישום של "שסתום הבקרה" לשליטה אלסטומרי המונע באופן עצמאי על מנת להגביל את תגובות CFPS (איור 2 א). כאשר ההתקן מונע, תאי הקרום נלחצו שקופיות הזכוכית להגביל ריאגנטים ניאון למערך של תאי תגובה (איור 2 ג). על מנת לוודא שהתאים באופן מהימן להגביל את התגובה דרך את משך הניסוי, FRAP בסיסי (הקרינה שחזור לאחר photobleaching) בדיקה נערך 37. Fluorophore (AF 555) היה מוחל על המכשיר, ושסתום הבקרה היה מונע; באמצעות צמצם התריס של המיקרוסקופ, יחיד גם כליאת fluorophore היה מבודד וphotobleached בנפרד (איור 2 ד). נבחר היטב הפך כהה ולא התאושש בבהירות עד שסתום הבקרה היה depressurized 20 דקות60; מאוחר יותר, משחרר את התא מהזכוכית. בדיקה זו מוודאת כי תאי תגובה אלה נשארים אטומים היטב לתקופת הניסוי. בתנאים אופטימליים, תגובת CFPS להביע חלבון דמיין בקלות (כגון GFP או בלוציפראז) מבטאת חלבון לזיהוי תוך כמה של מוחל על מכשיר זה דקות. במשך החיים של התגובה, סינתזת חלבון בפנים וחוץ של תאי התגובה היא הדמיה ולכמת על ידי מדידת יחידות של עוצמת הקרינה בתוך כל תא (איור 3 א). עוצמת הקרינה, מתאים לריכוז חלבון, עלולה להיות ממופה לאורך זמן לכל תא תגובה (איור 3D). ביטוי גנים הוא תהליך מיסודו סטוכסטיים שמציג תנודות (רעשים) על כל צעד ומולקולרי (סינתזה, השפלה, חלבון-DNA מחייב, וכו ') 20. סניף אחד של ביולוגיה רעש מתמקד בהערך הוכחתי רעש מעגל גן 41. ביטוי במערכות תא ללא יהיה השפעות רעש חיצוניות הנובעות מאינטראקציות בין המכונות מולקולריות של ביטוי והמשטחים המגדירים את הגבולות של כלי התגובה. השפעות חיצוניות אלה צפויים להיות בולטות יותר כתגובות תא ללא מוגבלות לתאי תגובה קטנים עוד יותר. היכולת לבצע זמן לשגות הדמיה של תגובות CFPS מוגבלות מרובות אז מאפשרת ניתוח זהיר של מבנה רעש (גודל ודינמיקה) במערכות תא ללא מוגבלות באופן ישיר דומה לשיטות שדווחו למערכות סלולריות 25. איור 3 ג ו3D להראות קורסי ביטוי GFP מכונן מאמרגן T7 הזמן בmicroplate 384 גם סטנדרטי עם גם נפח של 15 μl, בהשוואה לתאים בתגובה PDMS 10 מיקרומטר קוטר, המקביל לכרכים של רק כ -300 fl, על שבע כדישל גודל פחות. השונות בשיעורי ביטוי חלבון בתאי 10 מיקרומטר התגובה היא הרבה יותר גבוהות מאשר במדידות היטב צלחת, מתקרבים לאלה הנראים בתאים. תגובות מרובבות שבוצעו על המכשיר להציג קינטיקה דומה לתגובות CFPS מבוצעות בכמויות גדולות על microplate קורא (איור 3), שבו יש עלייה מהירה בקרינה שמישורים, לעתים קרובות להניח להיגרם על ידי הגבלת משאבים בתוך נפח התגובה 42,43 . זה התנהגות צמיחה דטרמיניסטית, למרות תנודות, היא בדרך כלל עקבית בכל תאי התגובה, ובין ניסויים – על ידי חישוב ממוצע עקבות בין תאים על פני ניסויים, המגמה הדטרמיניסטית עשויה להיגרע מערכי עקבות, שעזבה את רכיבי הרעש היחיד של התגובה (איור 4 א) . איור 4 מציג את רעש ביטוי GFP לאחר הסרת הרכיב הדטרמיניסטי, חולף (למעלה), וautocorrelation של הרעש (למטה), ואילו איור 4 א מציג את העקבות המקבילות ב10 מיקרומטר תאי תגובה. ההפצה במחצית-הפעמים של עקבות autocorrelation נותנת את התלות בתדר של הרעש, תוך זמן אפס הפיגור של עקבות autocorrelation נותן גדלים של הרעש, כשונות. 1. מגיבים סינתזה של חלבוני תא-חינם איור נכלאים בתאי תגובה בקנה מידה femtoliter לצורך מדידת רעש ביטוי גנים. ריאקטיבים ממערכת ביטוי חלבוני תא ללא מסחרית משמשים לconstitutively מפורש GFP בתוך מוגבלים תאי תגובת PDMS. מערך של תאים אלה עשויים להיות דמיין עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות כדי לאפיין ביטוי חלבון ורעש ביטוי גנים. O עוצמת הקרינהf כל תא תגובה לאורך הזמן ניתן להתוות כעקבות בודדות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. ייצור של מכשיר microfluidic דו שכבתי עם תאי femtoliter בקנה מידת סגר. פריסה () והתפוצצו תצוגה של שכבות מכשיר. המכשיר מורכב משתי שכבות PDMS וcoverslip זכוכית. קרום PDMS, האטום בין שכבות שסתום זכוכית ושליטה, מחזיק תאי התגובה. תמונת SEM (ב) לתא תגובת PDMS. הקוטר הפנימי הוא 10 מיקרומטר. סכמטי (C) של ערוצי קלט במכשיר. ריאגנטים Cell חלבון-חינם סינתזה (CFPS) מוטסים דרך ערוץ התגובה. מים בלחץ בשליטהשסתום כדי לדחוס את תאי התגובה נגד שקופיות הזכוכית, איטום החדרים 37. לשכפל מRef. 37 באישור האגודה המלכותית לכימיה. (D) שחזור הקרינה לאחר photobleaching מבחן (FRAP) על אחת גם באמצעות FITC מציין קאמרי הוא אטום היטב נגד סביבה חיצונית. Fluorophore נתפס בתאי (התמונה עליונה) וגם אחת היה photobleached (תמונה תחתונה). אין התאוששות הקרינה נתפסה בתא photobleached עד שסתום הבקרה שוחרר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ביטוי איור 3. EGFP בתגובת תא-חינם מרותקת. () תמונות הקרינה של אטום התגובה ג hambers בנקודות זמן שנבחרו בתגובה. ייצור חלבון שניתן לראות, הוא בתוך תאי התגובה ומחוץ לתאים בערוץ המרכזי. (ב) EGFP שובט לתוך וקטור Pet3a, מתן אמרגן פולימראז T7 ושליחות קטלנית ואתר הריבוזום החזק מחייב (RBS). (ג) מדידות הקרינה מנורמלות של ביטוי המכונן של EGFP בתגובת תא ללא תפזורת מתבצעת בקורא microplate. תגובות CFPS בדרך כלל לייצר חלבון במהירות לפני שההאטה לקרינה "מצב יציב" – זה קשור להגבלת משאבים 43. מקפים שחורים מציינים עקבות הממוצעת. הקרינה מנורמלת של 51 עקבות עוצמת הקרינה גלם לקרוא מ -51 תאי תגובה על כמה ניסויים (D). מקפים שחורים מציינים עקבות הממוצעת על פני מספר ניסויים, הממחישים את הרכיב הדטרמיניסטי של ביטוי החלבון."Target =" /52616/52616fig3large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. עקבות רעש פרט וautocorrelation רעש של מערכת סלולרית וניידת-חינם. (א) מאוסטין et al., 2006. רעש בביטוי של GFP (למעלה) ופונקציות מנורמלות autocorrelation (למטה) שנרכשו מייצור GFP מעקב בחיים חיידקים 25. הודפס מחדש באישור ממקמילן מוציאים לאור בע"מ: [טבע] 25 (. כרך 439), זכויות יוצרים (2006). רעש בביטוי של GFP (למעלה) ופונקציות מנורמלות autocorrelation (למטה) שנרכשו מייצור GFP במערכת תא ללא (B), במעקב בתאי תגובת מכשיר microfluidic. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

ביטוי גנים בתאים הוא מטבעו רועש בשל כרכים סלולריים קטנים ומספרים נמוכים עותק של מגיבים חשובים. ביולוגיה רעש לעתים קרובות מתמקדת במקורות, עיבוד, והשלכות ביולוגיות של תנודות באוכלוסיות, הריכוזים, עמדות, או המצבים של מולקולות השולטות מעגלים גנטיים ורשתות 44. הרוב המכריע של עבודה זו בוצע במערכות סלולריות, שבו יש את היתרון של הצפייה הרעש של מעגל גן בהקשר הטבעי של הרשתות הגנטיות בתוך התא. עם זאת, מערכות תא ללא מאפשרות האפיון של התנודות הפנימיות של מעגל גן בודד ללא תופעות חיצוניות המבלבלות 18 שלא ניתן להימנע במערכות סלולריות. ניתוח של רעש יכול להציע תובנות פיזיות חשובות לאיך גנטי מעגלים בנויים וכיצד הם פועלים, ונעשה שימוש במערכות סלולריות לאפיין 25 וחיוביים שליליים <sup> 27 autoregulation, חיצוני ופנימיות תרומות לרעש ביטוי 18, ותעתיק מתפוצצים 45,46. כאן אנו מתארים את המחקר של מערכת ביטוי תא ללא במכשירי microfluidic המאפשרים השליטה בו זמנית של פעמים גודל כור וייזום תגובה, על מנת להבין טוב יותר את התפקידים שכליאה בצפיפות ויש לי 47,48 על רעש ביטוי חלבון פנימי ללא סיבוכים הקשורים לתאים חיים.

מפתח הפעלת תכונה של העיצוב הוא שילוב של מערכים של femtoliter-נפח (מיקרון בקנה מידה) תאים המשמשים לכליאת תגובת המגיבים של מערכת ביטוי חלבוני תא ללא, עם קרום אלסטומרי "שסתום בקרה" בPDMS כי מלכודות מגיבים במוגדרים היטב "זמן אפס", לייזום תגובה (איור 1). שליטה זו מאפשרת קינטיקה של התגובות מעורבות בסינתזה של חלבונים שfollחב בזמן אמת עם דיוק גבוה. ככזה, חשוב לנהל מגיבים תא ללא כל כך שהשונות הבין-ניסיוניות ממוזערת ככל האפשר. שליטה זו מאפשרת לנו להעריך מבנה רעש של מעגלים גנטיים תא ללא באופן שדומה לטכניקות ששמשו בעבר להערכת ביטוי גנים בתאים חיים.

כמגיבים בשימוש במערכות CFPS יכולים להיות רגישים להפשרה להקפיא מחזורים, חשוב לשמור על המגיבים קרים ולצמצם את הזמן המגיבים מבלים הפשרה על קרח. זה תרגול טוב כדי לבדוק מעת לעת את הביטוי של מערכת CFPS בכמויות גדולה על מנת לזהות שינויים ברמות ביטוי לאורך זמן – זה יכול להיעשות בתגובת 10-15 μl בצינור Eppendorf, או במכשיר כמו קורא microplate , אשר מבצע מספר רב של קורא לאורך זמן כדי ללכוד קינטיקה תגובה. בשים לב לגיל והפשרה הפעמים של מגיבים לכל ניסוי יסייע לפתרון בעיות l ביטוי הנמוךevels. יתר על כן, כאשר הרכבת ריאגנטים CFPS, זה חשוב לציין כי התגובה תתחיל ברגע שהיא מורכב בהמלוא והוציאה מהקרח. על מנת לשמור על "זמן אפס" עולה בקנה אחד, כדאי להקליט את הזמן הבא הייזום של תגובת CFPS לאחר התוספת האחרונה של קלט DNA, וליישם את התגובה במהירות אפשרית למכשיר מודגרות. תהליך זה צריך לקחת כ 4-5 דקות, וקרינה לא צריכה להיות עדיין גלויה בתוך תאי התגובה. שליטה זו מבטיחה כי הזמן הפנוי כדי להמחיש את חלק הצמיחה של עקומת התגובה מוגדלת.

לפני הפעלת תגובות CFPS במכשיר, מומלץ להריץ בדיקות בקרת איכות כדי לוודא שאין דליפה מהתאים. מבחן FRAP ניתן לבצע (כמו באיור 2 ד) על ידי יישום fluorophore למכשיר ולחשוף גם בודד עד גם הוא מולבן לגמרי. אם התאים הםאטום היטב, אין התאוששות צריכה להיות גלויה בתוך היטב – לא אמור להיות ניגוד מוחלט בין קירות התא וחללי פנים וחוץ. אם התאוששות הקרינה היא לכאורה או הקירות של חדר התגובה אינם מוגדרים היטב, את הלחץ על שסתום הבקרה צריך להיות מוגבר או המכשיר צריך להיבדק לדליפה או delamination משקופיות הזכוכית.

פרוטוקול זה נבדק עם ריאגנטים CFPS מE. מסחרי ערכת coli תא ללא ביטוי חלבון (מדורגת 25 μl), אם כי ניתן להשתמש במערכות CFPS החזקה אחרות. ניתן להשתמש בכמויות נמוכות בהרבה מ -25 μl בעת החלת תגובות למכשיר, אשר עשוי להיות שימושיים כאשר עלות מגיב היא גורם מגביל בניסויים. ברגע שמגיבים מתווספים למכשיר ותאי התגובה חתומים, לא ניתן להוסיף מגיבים לפתרון ללא actuating-de שסתום הבקרה – כך המכשיר הזה הוא לא suitable לתגובות אשר דורשות התוספת של חומרים כימיים במהלך התגובה. מכשיר זה גם אינו מותאם לצפייה תגובות CFPS שיכול לרוץ יותר מ 3 שעות – ההשפעות של התייבשות וייבוש של המכשיר לאחר פרק זמן זה לא נבדק. אם זמני תגובה ארוכים יותר הם רצויים, השפעות אלו עשויות להיות מיתנו על ידי איטום המכשיר על מנת למנוע אידוי, שינוי טמפרטורת הדגירה, או על ידי שימוש בתא לחות. שינויים בעיצוב המכשיר, כגון מבני nanoporous בתא הקירות 49,50 או הכללת שכבת קרום נקבובית, מייצגים כמה שיטות שיכולים לאפשר חילופי מגיב ובכך להאריך את לוחות זמני תגובה.

תאי תגובת microfabricated של נפח אחיד הם בעלי ערך לשמירה על ממדים עקביים בניסויים ומתאימים מאוד לחקירה "תגובות צד" עם קירות התא. שלא כמו שיטות ללא שימוש בn microfabricated-טכניקות, התגובות האלה חייבת להיות מוערכות במספרים קטנים, ולא מספק גמישות ממדית במהלך ניסויים. עם זאת, העיצוב לשליטה לתאי תגובה אלה הוא מתאים ביותר עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות, ועשוי להיות משלימים מאירים לשיטת תפוקה גבוהה של כליאה.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 ga needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100x oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
sharp 23 ga needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexafluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
  2. Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
  3. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
  4. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
  5. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  6. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
  7. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  8. Karig, D. K., Jung, S. -. Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
  9. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
  10. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  11. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production – a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
  12. Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
  13. Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
  14. Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
  15. Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
  16. Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genética. 149, 1633-1648 (1998).
  17. Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
  18. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  19. McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
  20. Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
  21. Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
  22. Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
  23. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
  24. Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
  25. Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
  26. Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
  27. Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
  28. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
  29. Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
  30. Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
  31. Nomura, S. i. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
  32. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
  33. Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
  34. Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
  35. Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
  36. Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
  37. Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
  38. Herold, K. E., Rasooly, A. . Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, (2009).
  39. Unger, M. A., Chou, H. -. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  40. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
  41. Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
  42. Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. . American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
  43. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
  44. Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
  45. Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
  46. So, L. -. h., et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
  47. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
  48. Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
  49. Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -. K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
  50. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).

Tags

Cell-free BiologyFemtoliter ChambersPDMS DeviceCell-free Protein SynthesisReaction KineticsGene CircuitsNoise Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image