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Bioengenharia

Plombierbare Femtoliter Kammer Arrays für Zellfreie Biologie

Published: March 11, 2015
doi:
10.3791/52616
, , , , , ,
1Bredesen Center,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Nanophase Materials Sciences,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Materials Science and Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Abstract

Zellfreie Systeme bieten eine flexible Plattform für die Untersuchung spezifischer Netzwerke biologischer Reaktionen aus dem komplexen Ressourcen-Sharing isoliert (zB globale Genexpression, Zellteilung) begegnet in lebenden Zellen. Jedoch sind solche Systeme in herkömmlichen Makromaßstab Großreaktoren eingesetzt, oft nicht die dynamische Verhalten und Effizienz charakteristisch für ihren Lebensunterhalt im Mikromaßstab Pendants aufweisen. Das Verständnis der Auswirkungen der internen Zellstruktur und das Ausmaß an Reaktionsdynamik ist entscheidend für das Verständnis komplexer Gen-Netzwerke. Mikrohergestellte Vorrichtung, die zellfreie Reaktionen zellulärer Ebene Mengen beschränkt und ermöglicht flexible Charakterisierung der molekularen geschlossenen System Hier berichten wir. Diese mehrschichtige Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Gerät enthält Femtoliter angelegte Reaktionskammern auf einer Elastomer-Membran, die betätigt (geöffnet und geschlossen) werden kann. Wenn sie betätigt wird, die Kammern begrenzen die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) -Reaktionenein Fluoreszenzprotein exprimieren, so dass für die Visualisierung der Reaktionskinetik im Laufe der Zeit unter Verwendung von Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie. Hier zeigen wir, wie das Gerät verwendet, um das Rauschen Struktur CFPS Reaktionen in einer Weise, die direkt analog zu jenen verwendet werden, um zelluläre Systeme zu charakterisieren, wodurch die Verwendung von Rauschbiologischer Techniken in zelluläre Systeme ermöglichen soll CFPS Gen Schaltungen charakterisieren zu messen und ihre Wechselwirkungen mit dem zellfreien Umgebung.

Introduction

Zellfreie Systeme bieten eine vereinfachte und flexible Plattform für die Anzeige von biologischen Reaktionen frei von erschwerenden Faktoren wie Fitness, Division und Mutation, die bei der Untersuchung von lebenden Zellen unvermeidlich sind. Wurden solche Ansätze eingesetzt werden, um zelluläre Systeme einschließlich der Charakterisierung von Membranproteinen 1, das Sondieren von Proteininteraktionen 2 und der Erforschung der grundlegenden Aspekte der Übersetzung 3-7 studieren. Kürzlich zellfreien Systemen haben damit begonnen, ein Standbein als lebensfähige Plattformen für die synthetische Biologie 8-10 gewinnen. Der Reiz solcher Ansätze ist, dass sie frei Synthetische Biologie von der gemeinsamen Nutzung von Ressourcen und "extrinsische Lärm", die Reaktionsdynamik in lebenden Zellen wirkt. Doch Fragen bleiben, wie die physische Umgebung, in der zellfreien Reaktionen eingebettet sind beeinflusst den Verlauf und Ergebnis der Reaktion. Zellfreie Reaktionsumgebungen – besonders beschränkt environmEltern, die zell relevanten Mengen nähern – bleiben schlecht charakterisiert. Zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist konventionell Gedanke als "skalenfreien 'ausstellen gleichwertig Kinetik in einer Reihe von Mikroliter bis Liter-Maßstab Reaktionsvolumen 11. Dennoch hat beschränken Reaktionen auf zellulärer Ebene Volumen gezeigt, dass erhebliche Auswirkungen auf die Proteinexpression Raten 12.

Die stochastische Natur der zellfreien Reaktionen – vor allem, da diese Systemansatz oder sogar unterschreiten Femtolitervolumina – kann von besonderer Bedeutung sein. Lärm in der Genexpression ist eine Eigenschaft, stark von der Entbindung als kleine Zellvolumina und hohen Dichten von Komponenten beeinflusst zwingen viele wichtige Moleküle auf sehr niedrige Bevölkerungszahl – zum Beispiel Escherichia coli Grenzen innerhalb einer 1 fl Volumen nicht weniger als 4300 verschiedene Polypeptide unter die induzierbare Kontrolle von mehreren hundert verschiedenen Promotoren 13. Das Eigenrauschen hat als zentrale Triebkraft in zahlreichen biologischen Prozessen einschließlich Chemotaxis 14 in Verbindung gebracht, die HIV Entscheidung zwischen aktiven Replikation und Latenz 15, der λ-Phagen Entscheidung zwischen Lyse und Lysogenie 16,17 und dem Bacillus subtilis Entscheidung zwischen Kompetenz und Sporenbildung 17. Zellfreie synthetische Biologie bietet dann sowohl die Möglichkeit, die stochastischen Eigenschaften der zellulären Gen Kreise und Stromnetze zu erforschen und zu manipulieren diese Verhaltensweisen zu spezifischen technologischen Ziele zu erreichen. Während das Rauschverhalten des zellularen Systemen ist gut untersucht 18-27, hat es wenig Erforschung des Grundrauschverhalten des zellfreien Systemen 8, insbesondere auf der zellulären Ebene.

Hier stellen wir eine Plattform für die Untersuchung von stochastischen Effekten in zellfreien synthetischen Biologie. Diese mikro Plattform enthält Femtoliter angelegte Reaktion chambers die schnell zwischen offenen (freie Diffusion in und aus der Kammer) und geschlossenen (Reaktionspartner innerhalb der Kammer beschränkt) Zustände überführt werden kann. Im geschlossenen Zustand, beschränken wir die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) Reaktionspartner ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, und folgen Sie der Genexpression mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie 28 (Abbildung 1). Wir charakterisieren diese zellfreien Umgebung, indem die Struktur der stochastischen Schwankungen in der Genexpression in einer Weise direkt analog denjenigen verwendet werden, um Zellen 25 zu charakterisieren. Nicht-Mikrofabrikationsverfahren zum Eindämmen zellfreien Reaktionen umfassen Vesikel und Liposomen 29-32, Wasser-in-Öl-Emulsionen 12 und porösen Medien 33. Während diese Methoden können die Kontrolle über die Größenverteilung der abgeschlossenen Volumina 34 bereitzustellen, jedoch schaffen Mikromethoden hoch replizierbaren Funktionen mit fest vorgegebenen Abmessungen, auch im Nanobereich.Darüber hinaus sind diese starren Strukturen können leicht über die Zeit ohne anfällig Verdampfen oder Veränderungen in der externen Umgebung verfolgt werden. Microfabricated Behälter Entwürfe in früheren Arbeiten 8,35 verwendet nicht schnell dichten die Reaktionskammern folgenden Reaktionsauslösung, erschwert die eindeutige Zuordnung der Zeit, als die Reaktion (Zeitpunkt Null) gestartet. Unter Verwendung des hier vorgestellten Verfahren werden nur 4-5 min zwischen der Einleitung und Visualisierung der Reaktion an der Vorrichtung notwendig, wodurch eine gut definierte "Zeitpunkt Null". Die folgenden Protokolle beschreiben die Verfahren zur Herstellung und Prüfung dieses Gerät, einschließlich Photolithographie, Geräteanordnung, Gerätetests und Verfahren zur Bildanalyse.

Protocol

1. Optische Lithographie von Geräte-Masters Dehydratisieren saubere Siliciumwafer auf einer heißen Platte bei ~ 250 ° C für mindestens 1 Std. HINWEIS: Es wird empfohlen, mehr als einen Wafer verwenden bei der Herstellung eines Master, im Fall von Benutzerfehlern. Bereiten Fotolack Teilmengen. Bereiten Sie Teilmengen von beiden SU-8 2015 Photoresist und einer Verdünnung von SU-8 Fotolack 2015 im Verhältnis 2: 1 mit SU-8 dünner als Verdünnungsmittel. Anmerkung: Etwa 1 ml der Photoresist wird zum Schleuderbeschichten eines Wafers benötigt. Bereiten Sie drei Maskenmustern zur Herstellung dieser Meister. Für die Membran Meister, bereiten zwei Masken: eine Strukturierung der Membrankanal, der andere Strukturierung die Reaktionskammern. Für die Regelventil-Master, bereiten nur ein Maskenmuster. HINWEIS: Für weitere Informationen über lithographische Techniken, einschließlich Maske Strukturierung finden Ito und Okazaki, 2000. 36 Siehe Fowlkes und Collier, 2013 für eine ausführlichere Beschreibung der Geräteaufbau 37. Bereiten Sie die Membrane Meister Spin-Coat 2: 1 SU-8 2015 Fotolackverdünnung auf Wafer bei 1000 Umdrehungen pro Minute für 45 Sekunden. Softbake Wafer bei 95 ° C für 2 min. Mit Hilfe eines Kontaktausrichter, aussetzen Wafern mit Membrankanalmuster für 10 Sekunden, und führen Sie eine bake nach der Belichtung für 2 min bei 95 ° C. Entwickeln Wafer in SU-8-Entwickler für 1 min, oder bis Photoresistrückstände zu entfernen. Spülen Scheibe mit Isopropanol, sich von oben nach unten. Dry-Wafer mit Stickstoff wieder in Bewegung von oben nach unten. Bake Wafer bei 180 ° C für 4 min. Spin-Coat gemusterten Wafern wieder mit 2: 1 SU-8-Verdünnung bei 2000 Upm 45 Sekunden. Softbake gemusterten Wafer für 2 min bei 95 ° C. Mit Kontakt Aligner richten strukturierten Wafern mit Reaktionskammer Muster, und setzen für 10 Sekunden. Führen bake nach der Belichtung für 2 min bei 95 ° C. Entwickeln Wafer wie in Schritt 1.4.3 beschrieben. Nach dem Entwickeln und Trocknen von Wafern, backen Wafer bei 180 ° C für 4 min. HINWEIS: Die Wafer können in dem gleichen Entwickler, die in dem vorherigen Schritt verwendet wurde, entwickelt werden. Bereiten Sie das Regelventil Meister Spin-Coat unverwässert SU-8 auf die saubere Wafer bei 2000 Umdrehungen pro Minute für 45 Sekunden. Softbake Wafer bei 95 ° C für 6 min. Mit Hilfe eines Kontaktausrichter, aussetzen Wafer mit Regelventil Muster für 10 Sek. Führen Sie eine bake nach der Belichtung bei 95 ° C für 6 min. Entwicklung von Wafern in SU-8-Entwickler für 2 Minuten oder bis Reste entfernt. Spülen mit Isopropanol, sich von oben nach unten. Dry-Wafer mit Stickstoff und backen bei 180 ° C für 4 min. 2. PDMS Gerätefertigung Silanisieren alle Master mit etwa 0,2 ml Trimethylchlorsilan über Gasphasenabscheidung. Umschließen schnell den Master in einem luftdichten Behälter bei Raumtemperatur mit einigen Tropfen des Silanisierungsmittel. HINWEIS:. Andere Silanisierungsmittel Protokolle können akzeptabel sein 38 Wenn geführt properly, wird die PDMS leicht zu entfernen sein. Mischungs Kommerzielle Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Basis und Härter in verschiedenen Verhältnissen sowohl für die Membran und das Steuerventil Schichten der Vorrichtung, wie sie in ähnlicher mehrschichtigen Ventil nachgewiesen Designs 39. Verwenden von 20: 1 und 5: 1 Verhältnisse von Base: Härter für die Membran und das Steuerventil Formen sind. Für die Membranform, mischen Sie 10 g Boden mit 0,5 g Härter. HINWEIS: In diesem Band wird auf die Membran Master schleudert werden. Für das Steuerventil Schimmel, mischen Sie die Basis und Härter in einem Verhältnis 5: 1. Die Menge an PDMS notwendig, das Steuerventil wird von der verwendeten, das Steuerventil Master der Behälter hängen zu formen; Füllen des Behälters derart, daß der Master mit ~ 1 cm von PDMS beschichtet. Gut mischen sowohl PDMS Vorbereitungen und entgasen sie in einer Vakuumkammer, bis keine Luftblasen mehr sichtbar sind. Stellen Sie das Regelventil-Master in einem hitzebeständigenBehälter, wie beispielsweise eine Glasschale. Gießen Sie 5: 1-Verhältnis PDMS über den Meister, und De-Gas der Behälter ein zweites Mal. Während das Steuerventil PDMS Behälter wird entgast, Spin-Beschichtung der 20: 1-Verhältnis PDMS auf der Membran Master durch vorsichtiges Gießen der PDMS-Mischung auf die Membran Master Bildung von Luftblasen zu minimieren, dann Spinbeschichten des Master bei 1.000 UpM für 45 Sekunden. Teilweise zu härten beiden Mastern in einem Ofen bei 80 ° C für 6 min für die Membran-Master und 15 min für das Steuerventil Master. HINWEIS: Bei teilweise gehärtet, sollten die PDMS seine Form zu halten, aber das Material wird leicht klebrig sein. Wenn PDMS ist noch nicht ausgehärtet ist, backen wieder in Schritten von ein paar Minuten zu einer Zeit, bis das Material seine Form hält, wenn sie gedrückt. Schneiden Sie rechteckige Formen von PDMS Regelventil Master, Peeling die Formen entfernt sanft. Punch-Einlassöffnungen durch das Formteil mit einem 0,75 mm-Lochung. HINWEIS: Das Loch kann durch Einfügen eines 23 Gauge blun gereinigt werdent Spitze Nadel und die Form außen kann nicht mit Klebeband gereinigt werden, wenn nötig. Verwendung eines optischen Mikroskops, um die Reaktionskammern auf der Membran Meister zu suchen, richten Sie das Regelventil Formteil mit den Merkmalen der Reaktionskammer-Membran und legen Sie das Regelventil Komponente direkt auf der Membran-Master. Ausrichten der Steuerventileinlass zu der unteren linken Ecke des Geräts, und sicherzustellen, dass die Reaktionskammern und den Kanal der Membran Master innerhalb des rechteckigen Steuerventil sichtbar sind. Backen Sie die ausgerichteten Formkomponenten bei 80 ° C für 2 Stunden. HINWEIS: Die Membran und das Steuerventil Formen werden nun miteinander versiegelt werden, und als eine Form manipuliert. Schneiden Sie den geschichteten PDMS-Form von der Membran Master, Schälen der Form von der Master sehr vorsichtig, um nicht um die Membran zu perforieren. Punch-Ein- und Austrittsöffnungen für das Zellextrakt-Eingang mit einem 0,75 mm-Lochung. Lochen durch beide Schichten,und reinigen sie in der gleichen Weise wie in Schritt 2.6 beschrieben. Die Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmareiniger, Plasma behandeln sowohl die Form (Membranseite nach oben) und ein A-0 Deckglas mit 10,5 W 20 Sek. Unverzüglich entfernen das Deckglas und Form aus dem Plasma cleaner und Schicht die Komponenten, Membranseite zur Glas, versuchen, Lufteinschlüsse zwischen dem Glas und der Form zu minimieren. Direkt drücken nicht auf die Membran Eingangskanal oder die Membran an der Glas anlagern, so dass es schwierig ist, den Kanal mit Reaktanden zu füllen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Umgang mit den montierten Geräten zu vermeiden Brechen der Glasschicht. Verwenden Sie dünne Glasplättchen, da das Gerät muss durch den Deckglas mit hoher Vergrößerung Ölimmersionsobjektive abgebildet werden – wenn das Glas zu stark ist, können die Gerätefunktionen nicht sichtbar sein. Schließlich härten die fertigen Vorrichtungen bei 80 ° C für 2 Std. 3. Versuchsaufbau for zellfreien Proteinsynthesereaktion Hydratisieren eines Geräts durch Kochen in deionisiertem Wasser für 1 Stunde. HINWEIS: Das Gerät sollte ein trübes Aussehen haben, wenn vollständig hydratisiert. Vorrichtung auch O / N in sterilem Wasser bei Raumtemperatur, um es zu hydratisieren gelassen werden. Mit einem inversen Mikroskop mit einer Inkubationskammer, setzen Sie die Umgebungstemperatur auf 30 ° C. ANMERKUNG: Diese Temperatur wurde gewählt, um die Expression von GFP mit einem T7-Promotor zu optimieren, so dass eine optimale Temperaturen für andere Reaktionen können 40 variieren. Berg Gerät Bühne Halter mit Klebeband Mikroskop und wickeln Kanten Gerät nicht mit nassen Tissue-Papier, um lokale Hydratation beizubehalten. Verwenden Sie zwei hohe Präzision geregelte Spannung-Drucksensoren zur Stickstoffgasdruck für die Steuerventilbetätigung und Reagenz Eingang zu modulieren. HINWEIS: Dieses Protokoll wurde nur mit geringer Reinheit Stickstoff getestet, obwohl andere inerte Gase verwendet werden. Verbinden Sie den ersten Wandler durch24-Gauge-PTFE-Schlauch mit einem Wasserreservoir in einem 4-ml-Glasgefäß mit einem Septum Deckel gehalten. Schließen Sie das Reservoir mit dem Steuerventil Einlass mit einer zweiten Röhre durch eine 23 Gauge Nadel mit stumpfer Spitze abgebrochen. HINWEIS: Beide Rohre durchdringen das Reservoir Scheidewand mit zwei scharfen 23 Gauge-Nadeln. Schließen Sie das zweite Wandler von 24-Gauge-PTFE-Schlauch auf eine Mann-zu-Luer-Lok-Stecker angeschlossen. Befestigen Sie diese an einen Luer-Lok 23-Gauge-Nadel durch Schläuche mit einem anderen 23 Gauge Nadel mit stumpfer Spitze, die individuell für jedes Gerät montiert ist angeschlossen. Diese Nadel eine Verbindung mit dem Membranreaktionskanal; verwenden, um Wasser aus dem Reaktionskanal und Eingabe Reagenzien spülen. Verwendung eines zellfreien Proteinexpressionssystem, montieren die Komponenten für die CFPS Reaktion auf Eis, nach den Anweisungen des Herstellers. Minimieren Sie die Zeit damit verbracht halten CFPS Reagenzien auf Eis und legen Sie die Reaktion in das Gerät sofort nach der Montage. HINWEIS: Dieses Gerät wurdemit einem handelsüblichen E. verwendet coli extrahieren Protein-Expression-Kit und ein Plasmid konstitutiv GFP. Das gesamte Reaktionsvolumen wurde auf 25 ul skaliert – kann es möglich sein, eine noch niedrigere Volumen für Reaktanten zu verwenden, falls gewünscht. Wie CFPS Reagenzien neigen Zyklen Einfrieren-Auftauen empfindlich zu sein, kann es hilfreich sein Aliquots der Reagenzien bei dem entsprechenden Volumen vor dem Versuch zu machen. Andere Reagenzien können der Reaktionsmischung gegeben werden, aber die Reaktion ist vollständig, bevor sie an die Vorrichtung angelegt wird zusammengebaut werden. Montieren Sie die Reaktion, dass das DNA-Eingabe letzten. HINWEIS: Wenn in einem Eppendorf-Röhrchen montiert wird der CFPS Reaktion beginnen, wenn nicht auf Eis gehalten. Da die Zeit, die Reagenzien für das Gerät gültigen und beginnen das Experiment variieren genommen, ist es hilfreich, einen Timer zu starten, sobald die Reaktion zusammengefügt und vermischt – das wird die Zeitskala zwischen den Experimenten in Einklang, und die Hilfe bei der Fehlersuche zu halten. Mit derin Schritt 3.4.2 Schläuche und Nadelstecker und ziehen Sie die montierten Reaktion in das Rohr mit einer 1-ml-Spritze. Legen Sie die stumpfe Spitze Nadel in die Reaktionskammer Einlass. Nehmen Sie die Nadel-Stecker aus der Spritze und verbinden Sie es mit dem Mann-zu-Stecker für die Reaktionskammer Wandler verwendet. Üben Sie Druck (<10 psi) auf die CFPS Reaktionspartner, um den Kanal zu füllen. Nach Entfernen der Nadel, wenn die Reaktion aufgefüllt. Legen Sie die stumpfe Schlauch vom anderen Wandler in die Steuerventileingang. Noch das Regelventil nicht unter Druck setzen. Setzen Sie den Einbaugerät auf der Bühne. Mit Hellfeld-Bildgebung, suchen Sie die Reaktionskammern mit einer 100X Ölimmersionsobjektiv. Betätigen des Steuerventils durch Druckbeaufschlagung des Steuerventils Wandler bis 20 psi; eine sichtbare Veränderung in der Membran wird deutlich sein, wenn das Steuerventil betätigt wird. Konzentrieren Sie sich auf den Böden der Reaktionskammern. Beginnen Sie mit der Bildaufnahme; Wachstum in der Fluoreszenz will im Inneren und um das Äußere der Reaktionskammern sichtbar sein, obwohl es wahrscheinlich nicht erkennbar sind in den frühen Stadien der Reaktion. Machen Sie Bilder jede 1-3 Minuten, bis die Reaktion einen stationären Zustand Fluoreszenz erreicht. Wenn eine automatische Fokussierungsstufe nicht verfügbar ist, kurz refokussieren jedes Bild vor dem Bild getroffen. ANMERKUNG: Manche Photobleichen auftreten wird, kann die Wirkung auf die relative Fluoreszenz aufgrund Bleichen für so lange, wie die Geschwindigkeit der Photobleichen bekannt berücksichtigt werden. Das Photobleichrate kann durch Aussetzen einer fluoreszierenden Standard, wie beispielsweise eine bekannte Konzentration von GFP oder einem Fluorophor Gemisches konstant Bleichen über eine Zeitdauer geschätzt werden. Nehmen die Zeit von der Reaktionsanordnung an dem ersten erfassten Bild verstrichen ist. HINWEIS: Dies dauert in der Regel 4-5 min. 4. Bildanalyse und Datenverarbeitung Mit Hilfe eines Bildanalysesoftware wie ImageJ, wählen Sie dieInneren der Reaktionskammern als ROI. Erwerben Sie die mittlere Fluoreszenzintensität Wert des ROI für alle Bilder. HINWEIS: Dies ist die rohe Fluoreszenzintensität Spur. Führen Sie diese Aufgabe in ImageJ über die Zeitreihenanalyse und ROI-Manager-Plugins – Time Series Analyzer, um Bereiche von Interesse rund um das Innere eines jeden Reaktionsraum zu wählen. Stellen Sie "AutoROIProperties" zu einem Gebiet, in das Innere eines jeden Reaktionskammer entspricht, überprüfen Sie "Add On Click", und wählen Sie jede Kammer. HINWEIS: Dieser Schritt kann auch mit dem Ellipse-Werkzeug, um eine ROI um die Leuchtstoffkammer zu ziehen erfolgen. Dieser ROI Größe entspricht in der Regel einem 30 x 30 Pixel-Ellipse für eine 10 Mikrometer Durchmesser Kammer mit einem 100X Ziel angesehen. Markieren Sie alle ROIs in der ROI-Manager. Mit der Funktion "Multi Measure", um die Fluoreszenzintensität Mittelwert jeder ROI durch den gesamten Bildstapel zu bestimmen. HINWEIS: Ein Plug-In namens StackReg kann verwendet werden, um den Bildstapel ausrichten, wenn nötig werden. Nach dem Erwerb der rohen Fluoreszenzintensität Spuren für alle Kammern in einem Experiment, bestimmen die deterministische Komponente der Reaktion, indem sie ein inter experimentellen Durchschnitt über alle Spuren und Subtraktion der durchschnittlichen von einzelnen rohen Spuren. Verwenden Sie die Datenanalyse-Software wie IGOR oder MS Excel für diese Analyse. HINWEIS: Diese bietet Geräuschspuren für jede Reaktionskammer. Analysieren Sie den Genexpressions Lärm von dieser Reaktionsräume mit den gleichen verwendet werden, um die Genexpression Lärm von Zellen 25 abgeleiteten Analyse-Methoden.

Representative Results

Der entscheidende Vorteil dieser mikrofabrizierten Plattform ist bei der Anwendung des steuerbaren elastomer "Steuerventil", das unabhängig um CFPS Reaktionen (2A) zu begrenzen betätigt wird. Wenn die Vorrichtung betätigt wird, werden die Membrankammern gegen die Glasplatte gedrückt wird, um fluoreszierende Reagenzien in ein Array von Reaktionskammern (2C) zu beschränken. Um zu verifizieren, dass die Kammern zuverlässig beschränken die Reaktion durch die Dauer des Experiments wurde eine Grund FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Test 37 durchgeführt. Ein Fluorophor (AF 555) wurde auf die Vorrichtung aufgebracht, und das Steuerventil betätigt wurde; mit der Verschlußöffnung des Mikroskops ein einzelnes einfangen und das Fluorophor wurde isoliert und individuell gebleicht (2D). Die gewählte und wurde dunkel und nicht in der Helligkeit zu erholen, bis das Regelventil wurde 20 min entspannt60; später Lösen der Kammer aus dem Glas. Dieser Test überprüft, dass die Reaktionskammern bleiben für die Dauer des Experiments gut abgedichtet. Bei optimalen Bedingungen eine CFPS Reaktion eine leicht visualisiert Protein (wie GFP oder Luciferase) zum Ausdruck bringt nachweisbares Protein innerhalb von wenigen Minuten nach der an diese Einrichtung angelegt. Über die Lebensdauer der Reaktion wird die Proteinsynthese in dem Inneren und Äußeren der Reaktionskammern abgebildet und Messeinheiten der Fluoreszenzintensität in jeder Kammer (3A) quantifiziert. Fluoreszenzintensität, entsprechend Proteinkonzentration kann mit der Zeit für jede Reaktionskammer (3D) abgebildet werden. Die Genexpression ist ein stochastischer Prozess, der von Natur aus Schwankungen (Rauschen) bei jedem Molekular Schritt (Synthese, Abbau, Protein-DNA-Bindung, etc.) 20 führt. Ein Zweig der Lärm Biologie konzentriert sich aufdie Beweiskraft Gen Schaltungsrauschen 41. Expression in zellfreien Systemen müssen extrinsische Lärm Auswirkungen, die aus Wechselwirkungen zwischen der molekularen Maschinerie der Meinungsäußerung und den Oberflächen, die die Grenzen der Reaktionsgefäße zu definieren entstehen. Diese äußeren Auswirkungen wahrscheinlich stärker ausgeprägt als zellfreie Reaktionen werden in noch kleinere Reaktionskammern beschränkt. Die Fähigkeit, Zeitraffer-Imaging von mehreren beschränkt CFPS Reaktionen ausführen können dann die sorgfältige Analyse der Geräuschstruktur (Höhe und Dynamik) in geschlossenen zellfreien Systemen in einer Weise, direkt analog zu Verfahren, die für zelluläre Systeme 25 gemeldet wurden. 3C und 3D zeigen die Zeitverläufe der konstitutiven GFP-Expression von einem T7-Promotor in einem Standard-384-Well-Mikroplatte mit einem Vertiefungsvolumen von 15 & mgr; l, im Vergleich zu in PDMS Reaktionskammern 10 um im Durchmesser, was zu einem Volumen von lediglich ca. 300 fl, über Um siebens eine Größenordnung geringer. Die Variabilität in der Proteinexpressionsraten in den Reaktionskammern 10 um ist viel höher als in der Well-Platte Messungen, die denen in Zellen beobachtet. Multiplexed Reaktionen am Geräte weisen ähnliche Kinetik CFPS Reaktionen in der Masse auf einem Mikroplattenleser (3B), wo es einen raschen Anstieg in der Fluoreszenz, die Plateaus häufig angenommen, die von Ressourcenbegrenzung innerhalb des Reaktionsvolumens 42,43 verursacht werden durchgeführt . Das deterministische Wachstumsverhalten, wenn auch schwankende, sich im Allgemeinen über alle Reaktionskammern und zwischen den Experimenten – durch Mittelwertspuren zwischen den Kammern über Experimente kann die deterministischen Trend von Spuren Werten abgezogen werden, so dass nur die Rauschkomponenten der Reaktion (4A) . 4B zeigt die GFP-Expression Rauschen nach dem Entfernen des deterministischen, transiente Komponente (top) Und die Autokorrelation des Rauschens (unten), während Figur 4A zeigt die entsprechenden Spuren in den Reaktionskammern 10 um. Die Verteilung in den Halbwertszeiten der Autokorrelationsspuren gibt die Frequenzabhängigkeit des Rauschens während der Nullzeitverzögerung der Autokorrelationsspuren gibt die Grßen des Geräusches, da die Varianz. Abbildung 1. Zellfreie Proteinsynthese Reaktanten in Femtoliter Skala Reaktionskammern für den Zweck der Messung der Genexpression Rauschen beschränkt. Reaktanden aus einer kommerziellen zellfreies Protein-Expressionssystem verwendet werden, um konstitutiv GFP Inneren beschränkt PDMS Reaktionskammern. Eine Reihe dieser Kammern kann mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie, um die Proteinexpression und Genexpression Lärm charakterisieren visualisiert werden. Die Fluoreszenzintensität of jede Reaktionskammer im Laufe der Zeit kann als individuelle Spur aufgetragen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 2: Herstellung von zweischichtigen Mikrofluidvorrichtung mit verschließbaren Femtoliter angelegte Kammern. (A) Layout und Explosionsansicht der Bauteilschichten. Die Vorrichtung besteht aus zwei PDMS-Schichten und einem Deckglas besteht. Die PDMS-Membran, die zwischen den Glasschichten und das Steuerventil verschlossen, hält die Reaktionskammern. (B) REM-Aufnahme von PDMS Reaktionskammer. Der Innendurchmesser beträgt 10 um. (C) Schematische Darstellung der Eingangskanäle im Gerät. Zellfreie Proteinsynthese (CFPS) Reagenzien werden durch den Reaktionskanal eingeflogen. Wasser wird unter Druck in der SteuerVentil, um die Reaktionskammern gegen die Glasplatte zu komprimieren, die Abdichtung der Kammern 37. Wiedergabe aus Lit.. 37 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry. (D) Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Test auf einer einzigen gut mit FITC zeigt Kammer ist gegen äußere Umgebung gut verschlossen. Das Fluorophor wurde in den Kammern (obere Bild) erfasst und eine einzige Bohrung wurde gebleicht (unteres Bild). Keine Fluoreszenz Erholung wurde im fotogebleicht Kammer, bis das Regelventil veröffentlicht wurde gesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 3. EGFP Expression in Confined zellfreien Reaktion. (A) Fluoreszenzbilder von versiegelten Reaktions c Hambers an ausgewählten Zeitpunkten in der Reaktion. Die Proteinproduktion kann sowohl innerhalb der Reaktionskammern, die außerhalb der Kammern in den Hauptkanal zu erkennen. (B) EGFP wurde in eine pET3a-Vektor kloniert, die eine T7-Polymerase-Promotor und -Terminator und eine starke Ribosomenbindungsstelle (RBS). (C) Der normalisierte Fluoreszenzmessungen der konstitutiven Expression von EGFP in einem Bulk zellfreien Umsetzung in einem Mikroplattenlesegerät durchgeführt. CFPS Reaktionen produzieren normalerweise Protein schnell vor Verlangsamung zu einem "stabilen Zustand" Fluoreszenz – dies ist mit Ressourcenbegrenzung 43 verbunden. Schwarze Striche zeigen die durchschnittliche Spur. (D) normalisierte Fluoreszenz von 51 raw Fluoreszenzintensität Spuren von 51 Reaktionskammern über mehrere Experimente zu lesen. Schwarze Striche zeigen die mittlere Spur über mehrere Experimente, die die deterministische Komponente der Proteinexpression zu illustrieren./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 4. Individuelle Geräuschspuren und Lärmautokorrelation eines zellulären und zellfreien System. (A) von Austin et al., 2006 Geräusch in GFP-Expression (oben) und normierte Autokorrelationsfunktionen (unten) von Tracking GFP-Produktion in lebenden Bakterien 25 erworben. Werden mit Genehmigung von Macmillan Publishers Ltd Nachdruck: [Natur] 25 (Vol. 439), Copyright (2006). (B) Lärm in die GFP-Expression (oben) und normierte Autokorrelationsfunktionen (unten) von GFP-Produktion in zellfreien System erworben, in Mikrofluidik-Vorrichtung Reaktionskammern verfolgt. Bitte klicken Sie hierum eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Genexpression in Zellen von Natur aus laut, da kleine Zellmengen und geringen Kopienzahl wichtige Reaktanten. Rausch biology konzentriert sich oft auf die Quellen, die Verarbeitung und biologischen Konsequenzen von Schwankungen in den Populationen, Konzentrationen, Positionen oder Zustände von Molekülen, die Gen-Schaltungen und Netzwerke 44 steuern. Die überwiegende Mehrheit dieser Arbeit in zellularen Systemen, die den Vorteil der Betrachtung der Lärm eines Gens Schaltung im natürlichen Kontext der genetischen Netzen in der Zelle durchgeführt. Jedoch zellfreien Systemen ermöglichen die Charakterisierung der Eigenschwankungen eines einzelnen Gens Schaltung ohne die verwirrende extrinsischen Effekte 18, die nicht in zellularen Systemen vermieden werden können. Analyse von Lärm kann wichtige physikalische Erkenntnisse darüber, wie genetische Schaltkreise sind so strukturiert und wie sie funktionieren bieten und ist in zellulären Systemen verwendet worden, um zu charakterisieren negativen 25 und positive <sup> 27 Autoregulation, extrinsische und intrinsische Beiträge zum Ausdruck Lärm 18 und Transkriptions platzen 45,46. Hier beschreiben wir die Studie eines zellfreien Expressionssystem in mikrofluidischen Systemen, das die gleichzeitige Steuerung von Reaktorgröße und Reaktionszeiten Einleitung zu aktivieren, um die Rollen, die Enge und Gedränge 47,48 verfügen über inhärente Proteinexpression Rauschen ohne die besser zu verstehen Komplikationen, die mit lebenden Zellen verbunden sind.

Der Schlüssel ermöglicht Merkmal der Konstruktion ist die Integration der Anordnungen von Femtoliter-Volumen (im Mikrometermaßstab) zum Eindämmen der Reaktanten eines zellfreien Proteinexpressionssystem, mit einem elastomeren "Steuerventil" Membran in PDMS, die die Fallen verwendeten Reaktionskammern Reaktanten bei einer wohldefinierten "Zeitpunkt Null" zur Reaktionsauslösung (Abbildung 1). Diese Steuerung ermöglicht es, die Kinetik der Reaktionen in der Proteinsynthese beteiligt zu werden follin Echtzeit mit hoher Präzision zu verdanken. Als solches ist es wichtig, zellfreien Reaktanten zu verwalten, so dass inter experimentellen Variabilität wird soweit wie möglich minimiert. Diese Steuerung ermöglicht es uns, Rausch Struktur zellfreien genetischen Schaltungen in einer Weise, die analog ist zu bisher verwendeten Techniken, um die Genexpression in lebenden Zellen zu bewerten bewerten.

Als Reaktanten in CFPS Systeme verwendet werden, um Zyklen Einfrieren-Auftauen empfindlich sein, ist es wichtig, um die Reaktanten kalten und minimieren die Zeit die Reaktanten verbringen Auftauen auf Eis. Es empfiehlt sich, in regelmäßigen Abständen die Expression des CFPS System zu testen in Groß, um Veränderungen in der Expressionsniveaus im Laufe der Zeit zu erkennen – das kann in einer 10 bis 15 & mgr; l-Reaktion in ein Eppendorf-Röhrchen durchgeführt werden, oder in einem Gerät wie einem Mikroplattenleser , die mehrere führt liest über die Zeit, um die Reaktionskinetik zu erfassen. In Anbetracht der Alters- und Auftau-Zeiten der Reaktanden für jedes Experiment hilft bei der Fehlersuche gering Ausdruck levels. Wenn darüber hinaus die Montage CFPS Reagenzien ist es wichtig zu beachten, daß die Reaktion beginnt, nachdem es vollständig zusammengesetzt ist und aus dem Eis entfernt wird. Um eine konsistente "Zeitpunkt Null" zu halten, ist es hilfreich, die Zeit aufzuzeichnen folgenden Einleitung des CFPS Reaktion nach der letzten Zugabe der DNA-Eingang, und die Reaktion so schnell wie möglich zu dem inkubierten Gerät anzuwenden. Dieser Prozess sollte ungefähr 4-5 Minuten dauern, und Fluoreszenz sollte noch nicht in den Reaktionskammern sichtbar sein. Diese Steuerung stellt sicher, daß die verfügbare Zeit, um das Wachstum Teil der Reaktionskurve visualisieren maximiert.

Bevor Sie CFPS Reaktionen auf dem Gerät, ist es ratsam, führen Qualitätskontrolltests, um sicherzustellen, gibt es keine Leckage aus den Kammern. A FRAP Test kann (wie in Figur 2D) durch Anlegen eines Fluorophors an das Gerät und Belichtung eines einzelnen gut, bis das Bohrloch vollständig gebleicht geführt werden. Wenn die Kammerngut verschlossen, keine Erholung sollte in der gut sichtbar sein – es sollte ein starker Kontrast zwischen den Wänden der Kammer und den Innen- und Außenraum sein. Wenn die Fluoreszenzrück offensichtlich oder die Wände der Reaktionskammer sind nicht gut definiert, sollte der Druck auf das Steuerventil erhöht werden, oder das Gerät auf Undichtigkeiten oder Delaminierung von dem Glasträger überprüft werden.

Dieses Protokoll wurde mit CFPS Reagenzien von einer kommerziellen E. getestet coli zellfreien Proteinexpression Satz (25 ul skaliert), obwohl andere robuste CFPS Systeme verwendet werden. Es ist möglich, Mengen zu verwenden sehr viel niedriger als 25 & mgr; l bei Anwendung Reaktionen auf die Vorrichtung, die nützlich sein können, wenn Reagenz Kosten ein begrenzender Faktor bei Experimenten. Sobald Reaktanten zu der Vorrichtung gegeben und die Reaktionskammern abgedichtet sind, ist es nicht möglich, Reaktionsteilnehmer zu der Lösung ohne de-Betätigung des Steuerventils hinzuzufügen – somit ist dieses Gerät nicht dafür geeignetele für Reaktionen, die die Zugabe von Reagenzien während des Verlaufs der Reaktion erforderlich. Die Wirkungen der Entwässerung und Trocknung der Vorrichtung nach dieser Zeit wurden nicht untersucht – Auch diese Vorrichtung ist nicht für die Beobachtung CFPS Reaktionen, die länger als 3 Stunden laufen kann optimiert. Wenn längere Reaktionszeiten gewünscht werden, können diese Effekte durch das Abdichten der Vorrichtung um Verdunstung zu verhindern, die Änderung der Inkubationstemperatur, oder durch Verwendung einer Feuchtigkeitskammer abgeschwächt werden. Modifikationen an dem Gerätedesign, wie nanoporösen Strukturen in den Kammerwänden 49,50 oder die Aufnahme einer porösen Membranschicht, für ein paar Methoden die Reagenzaustausch ermöglichen und damit senken Reaktionszeitskalen könnte.

Microfabricated Reaktionskompartimente einheitlicher Lautstärke sind wertvoll für die Aufrechterhaltung konsistenter Dimensionen über Experimente und sich sehr gut zur Untersuchung von "Nebenreaktionen" mit den Fachwänden. Im Gegensatz zu Methoden mit nichtn-Techniken mikro, diese Reaktionen sind in kleinen Stückzahlen bewertet werden, und nicht dimensionale Flexibilität während Experimente liefern. Jedoch ist die steuerbare Entwurf für diesen Reaktionskammern sehr gut zur Zeitraffermikroskopie, und kann eine Beleuchtungs Ergänzung zu einer Hochdurchsatzverfahren von der Entbindung.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 ga needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100x oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
sharp 23 ga needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexafluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version
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Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).
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