Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Leverinflammation som ett svar på skada är en mycket dynamisk process med infiltration av distinkta subtyper av leukocyter inklusive monocyter, neutrofiler, T-cell undergrupper, B-celler, naturliga mördar (NK) och NKT-celler. Intravital mikroskopi av levern för att övervaka immuncellmigration är speciellt utmanande på grund av de höga krav på provberedning och fixering, optisk upplösning och långsiktig djur överlevnad. Ändå kunde dynamiken i inflammatoriska processer samt cellulära interaktionsstudier ger viktig information för att bättre förstå initieringen, progression och regression av inflammatorisk leversjukdom. Därför gjordes en mycket känslig och tillförlitlig metod etablerats för att studera migration och cell-cell-interaktioner av olika immunceller i muslever under långa perioder (ca 6 h) genom intravital två-foton-laserskanning mikroskopi (TPLSM) i kombination med intensivvård övervakning.
ent "> Den metod som innefattar en mild förberedelse och stabil fixering av levern med minimal störning av orgeln, långsiktiga intravital avbildning med multicolor multifotonmikroskop med praktiskt taget ingen fotoblekning eller fototoxiska effekter under en tidsperiod på upp till 6 timmar, vilket gör spårning av specifika leukocyter delmängder samt stabila avbildningsförhållanden på grund av omfattande övervakning av mus vitala parametrar och stabilisering av cirkulation, temperatur och gasutbyte.För att undersöka lymfocytmigration vid leverinflammation CXCR6.gfp knock-in-möss utsattes för intravital avbildning av levern enligt utgångsläget och efter akut och kronisk leverskada inducerad genom intraperitoneal injektion (er) av koltetraklorid (CCI4).
CXCR6 är en kemokinreceptor uttrycks på lymfocyter, främst på Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) – och undergrupper av T-lymfocyter såsom CD4 T-celler utan även slemhinnor Associrerad invariant (MAIT) T-celler 1. Efter migrationsmönster och placering av CXCR6.gfp + immunceller får en detaljerad inblick i deras förändrade beteende vid leverskada och därmed deras potentiella inblandning i sjukdomsförloppet.
Visualiseringen av celler och cellfunktioner i hela organ eller till och med hela organismer har varit av stort intresse för mer än 50 år, däribland praktiskt taget alla delar av kroppen 2. Därför vissa tidiga studier redan anställda intravital avbildning av levern 3,4. Det finns dock flera begränsningar uppdaterade om långsiktigt stabil högupplösta avbildning av levervävnad.
På grund av den anatomiska positionen av levern i nära kontakt med membranet och mag-tarmkanalen 5, det vanligaste problemet för mikroskopisk intravital avbildning är rörelser som beror på andning och, i mindre utsträckning, peristaltisk av tarmkanalen 6. I jämförelse med andra fasta organ, är leverkirurgi särskilt utmanande. På grund av den täta mikrovaskulära strukturen, kan kirurgisk manipulation leda till massiva hemorragiska skador, nedsatt mikrocirkulation 7 och även aktivering av bosatta immune celler såsom Kupffer-celler 8. Därför mekanisk fixering av vävnaden som publicerats på annat håll 6,9 sannolikt störa intravital mikroskopi avbildning.
I en frisk lever, bosatt 10-15% av den totala blodvolymen i levern vaskulaturen, och orgeln mottar cirka 25% av den totala hjärtminutvolym 10, rendering orgeln mycket mottagliga för ändringar i cirkulationen (t.ex. blodtrycksfluktuationer ). Därför kommer störningar i leverblodflödet grund av t.ex. skjuvspänning, förskjutning, skada av överdriven hantering vävnad eller centraliserad cirkulation leda till artificiella förändringar i leukocyt vandrande beteende, nedsatt lever syresättning och därmed ytterligare leverskador, som påverkar leverimmunsvar samt som organbevarande och övergripande livstiden för djuret.
Tidiga mikroskopiska studier baserades på intravital epifluorescence microscopy, men flera tekniska begränsningar, till exempel fotoblekning och låg penetrationsdjup begränsa användningen av denna teknik för långsiktig avbildning av levern 4,11,12. Med utvecklingen av multifoton mikroskopi på 1990-talet, var begränsningarna i fotoblekning eller penetrationsdjup främst lösas, eftersom denna nya metod var tekniskt kapabla att utföra imaging studier i praktiskt taget alla organ enligt verkliga situationer 13-15. Men de viktigaste återstående utmaningar när det gäller avbildning av levern var: breath rörelser, autofluorescens av levervävnad, säkra oförändrat blodflöde i lever sinusoider, och speciellt stabil avbildning för längre perioder av flera hr 16.
Trots att flera studier adresserade funktion och migration av olika leukocyter i levern 17, t.ex. NKT-celler 18-20, T-celler 21,22, levermakrofager 23,24 eller neutrofiler 25, långsiktig multifoton microscopy avbildning hade ännu inte upprättats, en uppgift ännu svårare hos djur med akut eller kronisk leversjukdom på grund av den befintliga skador och därmed högre känslighet för ytterligare skador 26. Men övervakning vandrande beteende och cellulär funktion av leukocyter i levern i realtid möjliggör nya insikter i sin speciella roll i lever homeostas och sjukdom 27.
Kemokinreceptorn CXCR6 uttrycks på flera lymfocytundergrupper, inklusive naturliga mördarceller (NK) celler, NKT-celler och vissa T-cellspopulationer 18,28. Tidigare studier på möss har visat att CXCR6 och dess tillhörande ligand CXCL16 kan styra patrullering av NKT-celler på lever sinusoids under homeostas. Följaktligen har användningen av CXCR6.gfp möss (som bär en knock-in av grönt fluorescerande protein [gfp] i CXCR6 lokuset) beskrivits för att undersöka migration av lymfocyter i olika organ såsom hjärna 29och även levern 18,20, visande ökad infiltration av CXCR6.gfp celler vid inflammation.
Med den metod som i denna studie var det möjligt att följa dessa processer under en lång tid under stabila förhållanden. Den intravital multifotonbaserad förfarande tillåts avbildning som var mycket reproducerbar med minimal störning av djuret och orgel; optimerad för långsiktig djuröverlevnad av omfattande övervakning följt av noggrann kontroll av andning och cirkulation; och mycket flexibel och lätt att även anta andra parenkyma organ såsom njure eller mjälte.
Syftet med vår studie var att utveckla en mycket standardiserad, stabil och reproducerbar metod för intravital TPLSM avbildning av levern. Intravital avbildning i allmänhet har gett värdefulla insikter i cellulär beteende under verkliga förhållanden efter målsökande och samverkan mellan olika leukocytpopulationer inom utveckling, homeostas och sjukdom. Men något utmanande anatomiska position levern, på grund av vilka andnings och peristaltiska tarmrörelser direkt överförs till levern liksom deras höga br?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Anesthetics | |||
Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
Glucose 5% | Braun | ||
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
Consumable supplies | |||
20ml Syringe | BD Plastipak | ||
250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
2ml syringe | BD Plastipak | ||
4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
Agarose | commercially available | ||
Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
Tissue paper | commercially available | ||
Surgical Instruments | |||
Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
Equipment | |||
ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
Perfusor Compact | B. Braun | ||
PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
Temperature sensor | comercially available | ||
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |