Long Term intra multiphoton Mikros Imaging av immunceller i friske og syke leveren Bruke CXCR6.Gfp Reporter Mus

Visualisering av celler og cellefunksjoner i hele organer eller hele organismer har vært av stor interesse for mer enn 50 år, inkludert nesten alle deler av kroppen ^2. Derfor noen tidlige studier allerede anvendt intravital avbildning av leveren ^3,4. Men flere begrensninger eksisterer oppdatert om langsiktig stabil høyoppløselig avbildning av leveren vev.

På grunn av den anatomiske stilling av leveren i nær kontakt med membranen og mage-tarmkanalen ^5, er den mest vanlig problem for mikroskopisk intrabilde bevegelse på grunn av respirasjon, og, i mindre grad, peristaltiske av tarmkanalen ^6. I forhold til andre faste organer, er leverkirurgi spesielt utfordrende. På grunn av den tette microvascular struktur, kan kirurgisk manipulering føre til massive hemoragisk lesjoner, nedsatt mikrosirkulasjon ⁷ og også aktivering av bosatt i-immun celler som Kupffer celler ^8. Derfor, mekanisk fiksering av vevet som i andre sammenhenger ^6,9 er sannsynlig å forstyrre den intramikros bildebehandling.

I en frisk lever, befinner seg 10 til 15% av det totale blodvolum i leveren vaskulaturen, og organ mottar rundt 25% av den totale blodsirkulasjon ^10, slik at organet meget følsom for endringer i sirkulasjon (f.eks, blod trykkfluktuasjoner ). Derfor vil forstyrrelser i leverblodstrømmer på grunn av f.eks skjærspenning, fortrengning, skade av overdreven vev håndtering eller sentralisert sirkulasjon føre til kunstige endringer i leukocytter trekkadferden, nedsatt leveroksygenering og derfor ytterligere skade leveren, påvirker leveren immunresponser samt som organbevaring og total levetid av dyret.

Tidlige mikroskopiske studier var basert på intra epifluorescence microscopy, men flere tekniske begrensninger som foto bleking og lav penetrasjon dybde begrense bruken av denne teknikken for langsiktig leveren bildebehandling ^4,11,12. Med utviklingen av multiphoton mikros på 1990-tallet, ble begrensningene i fotobleking eller inntrengningsdybde i hovedsak løst, som denne nye metoden var teknisk i stand til å utføre imaging studier i nesten alle organer i henhold til virkelige situasjoner ^13-15. Men de viktigste gjenværende utfordringer når det gjelder diagnostikk av lever var: pusten bevegelser, autofluorescence av levervev, sikring uforandret blodgjennomstrømningen i lever sinusoids, og spesielt stabil bildebehandling for lengre perioder av flere hr ^16.

Selv om flere studier adressert funksjons og migrering av forskjellige leukocytter i leveren ^17, f.eks NKT-celler, T-celler ^{18 til 20 21,22, 23,24} levermakrofager eller neutrofiler ^25, langtids multiphoton microscopy bildebehandling hadde ennå ikke er opprettet, en oppgave enda mer utfordrende i dyr med akutt eller kronisk leversykdom på grunn av den eksisterende skader og derfor høyere mottakelighet for ytterligere skade ^26. Men overvåking trekkadferden og cellulær funksjon av leukocytter i leveren i sanntid gjør at ny innsikt i deres spesielle rolle i lever homeostase og sykdom ^27.

Kjemokinreseptoren CXCR6 uttrykkes på flere lymfocytt-delmengdene, inkludert naturlige killer (NK) celler, NKT-celler og noen T-celle-populasjoner ^18,28. Tidligere studier på mus har indikert at CXCR6 og dens beslektede ligand CXCL16 kan kontrollere patruljering av NKT celler på lever sinusoids under homeostase. Følgelig har bruken av CXCR6.gfp mus (som bærer et knock-in for grønt fluorescerende protein [GFP] i CXCR6 locus) er beskrevet for å undersøke overføringen av lymfocytter i forskjellige organer som hjernen ²⁹og også lever ^18,20, som viser økt infiltrasjon av CXCR6.gfp celler på betennelse.

Med fremgangsmåten er gitt i denne studien var det mulig å følge disse prosesser over et langt tidsrom under stabiliserte betingelser. Den intravital multiphoton basert fremgangsmåte tillater avbildning som var meget reproduserbar med minimal forstyrrelse av dyret og det organ; optimalisert for langsiktig dyr overlevelse ved omfattende overvåkning fulgt av tett kontroll av respirasjon og sirkulasjon; og svært fleksibel og enkel å ta i bruk også til andre parenkymatøs organer som nyre eller milt.