Вперед Генетика экранов с помощью макрофагов Определение<em> Токсоплазма</em> Гены важен для достижения стойкости к ИФН-γ-зависимая клеточно автономного Иммунитет

Токсоплазма (T.gondii,) является облигатным внутриклеточным, протозойная патоген. Это возбудитель токсоплазмоза, опасность для здоровья у ослабленных лиц. Это также модель системы для других apicomplexan патогенов, поражающих человека, включая Cryptosporidium и циклоспора. Токсоплазмоз чаще приобрела при проглатывании пищи или воды, зараженной bradyzoite или ооцист стадии паразита. При приеме внутрь, эти этапы преобразования на сцену tachyzoite паразита, который воспроизводит в клетках-хозяевах и распространяет системно. Т-клетки, IFN-γ и, в меньшей степени, окиси азота ^1-4, имеют важное значение для контроля инфекции, но не способны устранить заболевание, как доля тахизоитов преобразовать в стадии bradyzoite, которые защищены в тканевых кист в результате чего долгоживущих хронической инфекции. В самом деле, нет терапия эффективна против хронической кисты сщество заболевания. Тяжелая токсоплазмоз чаще всего из-за реактивации хронической инфекции, от стадии bradyzoite паразита преобразования обратно в быстро тиражирование tachyzoite стадии, характерной для начального и острой инфекции.

В начале выживаемости в условиях врожденного иммунного ответа важно, чтобы паразит чтобы достичь достаточного количества паразитов, а также достичь дистальных участков, чтобы позволить создание хронической инфекции. Т. гондий превратилась стратегии по противодействию защитными механизмами, которые, вероятно способствуют ее способности к репликации и распространения в начале инфекции. Во-первых, Т. гондий образует уникальную PV в течение паразита вторжения, которое в значительной степени отделены от эндоцитических и exocytic процессов в клетке-хозяине по сравнению с другими внутриклеточными патогенными микроорганизмами ^5-9. Кроме того, как всех успешных внутриклеточных патогенов Т. гондий изменяет свою клетку-хозяина, чтобы создать питательную среду Fили рост. Это включает в себя экспрессию генов клетки-хозяина перепрограммирования изменения факторов клетка-хозяин транскрипции в том числе важная для урегулирования активации клеток ^10-15. ROP16 ^16-19, GRA15 ^{20, 21} и GRA16 GRA24 ²² все было показано, что важную роль в регуляции транскрипции реакцию и сигнализации клеток каскады клеток-хозяев, инфицированных T. гондий. Последние исследования с использованием генетических скрещиваний штаммов паразитов с различными фенотипами были весьма продуктивными в выявлении паразитов гены, которые лежат в основе паразитов генотипов в зависимости от качества, включая уклонение от иммунитета, связанных с ГТФ (IRGs) ^16,19,23-26. У мышей, связанных с помехоустойчивостью GTPases (IRGs) имеют решающее значение для контроля типа II и III генотипов паразита в то время как очень вирулентных типа I генотипы развивались механизмы, чтобы избежать мышиных IRGs. Тем не менее, это также ясно, что паразит развили механизмы, чтобы избежать антимикробной СМИТЗ в дополнение к IRGs и что некоторые из этих механизмов может быть сохранена через паразитов генотипов ^27,28. Кроме того, очень мало известно о критических медиаторов клеточного иммунитета против автономного Т. гондий во время человеческой токсоплазмоза. Parasite гены, важные для устойчивости к медиаторам клеточного автономного иммунитета также может быть важным для выживания во время tachyzoite в bradyzoite преобразования, которые также могут быть вызваны иммунной реакции. Например, оксид азота при высоких уровнях может подавить паразитов репликации в инфицированных макрофагах, но он также может стимулировать tachyzoite чтобы bradyzoite преобразование полученного в производстве кисты ^30-32.

ToxoDB является функциональная геномной базы данных для Т. гондий, который функционирует как критический ресурс для области с точки зрения предоставления информации последовательности для генома паразита, и доступ к опубликованной и неопубликованной геномной объемами данных, включая общинные аннотации, ген ехр ression и протеомики данных ^33. Как и во многих протозойных патогенов, большинство генома состоит из гипотетических генов с-либо информация на основе генной гомологии дать представление о своих потенциальных функций. Таким образом, передние генетика мощный инструмент для идентификации новых генов паразита, важные для иммунной уклонения, преобразования кисты и других функций, важных для паразита патогенезе, а также для преобразования между различными стадиями развития. Дополнительная прочность вперед генетики является то, что он может быть использован как относительно не необъективной подхода опрашивать паразита, как в генах, которые важны для выполнения конкретных задач в патогенезе, в том числе иммунной уклонения и образованию кист. Последние достижения в области следующего поколения секвенирования для мутационного профилирования сделали это метод выбора для определения ответственного паразитов гены от передних ДНК-исследований с использованием как химического, так и инсерционного мутагенеза ^34-37.

ntent "> Важно определить уязвимости в T.gondii, которые могут быть использованы для повышения эффективности клеточных автономных иммунных механизмов против паразита особенно те, которые могут быть активны в отношении устойчивых стадии кисты. С этой целью, в пробирке мышиные инфекции макрофагов и модель активации была разработана для идентификации мутаций в паразита, который специально ухудшает T.gondii, фитнес После активации инфицированных макрофагов, но не у наивных макрофагов. Этот экран макрофагов была использована, чтобы допросить библиотеку T.gondii, инсерционных мутантов, чтобы в конечном счете определить T.gondii, гены, важные для сопротивления оксида азота ^27,28. обособлению панели T.gondii, мутантов с нарушениями резистентности к активации инфицированных макрофагов, в частности, к заметному чувствительности к окиси азота, доказали полезность экране, чтобы определить паразит гены, важные для сопротивлениячтобы медиаторов клеточного иммунитета автономной кроме механизмов сопротивления, описанных для мышиных IRGs ^28. Инсерционного мутагенеза имеет преимущества по сравнению с химического мутагенеза в плане генерации ограниченное количество случайных мутаций в каждом клоне паразита и, в теории, простоты идентификации сайта мутации. Тем не менее, определение геномной сайт вставки плазмиды в Т. гондий инсерционные мутанты, на практике, было удивительно трудно во многих случаях ^37. Введение плазмиды в ген также может нарушить функцию гена в отличие от химического мутагенеза, которые, как правило, приводит в единичных нуклеотидных замен. Тем не менее, химический мутагенез или с N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ) или этилметансульфонатом (EMS) могут предложить повышенную способность к анализу большую часть генома паразита, по сравнению с инсерционного мутагенеза, так как он создает несколько полиморфизмов одного нуклеотида ( оценивается в 10 -100) в мутанта ³⁴, 38. Кроме того, последние достижения в целый геном профилирования стало возможным использовать следующего поколения секвенирования для выявления наиболее вероятных генов-кандидатов, ответственных за выявленного фенотипа мутантного паразита ^34,38. Независимо от подхода мутагенеза, подтверждение роли гена паразита в устойчивости к активации макрофагов в конечном счете, требует делеции гена и дополнения для выполнения постулаты Коха молекулярный.

Способность анализировать функции гена посредством генетической манипуляции как паразита и макрофагов важно, так как многие из генов, идентифицированных с помощью форвардных генетики в T. гондий, а также другие патогены, по-прежнему характеризуется как гипотетических генов, практически не гомологии с другими белками с известными функций. В настоящем документе описаны общий подход, который может использоваться, чтобы определить, является ли значение для устойчивости к известной или нарушена гена в мутантанеизвестно медиатором клеточной автономной иммунитета. Первоначальный анализ принимающих антимикробных факторов осуществляется путем оценки выживаемости дикого типа и мутантных паразитов в макрофагах из мышей дикого типа по сравнению с теми, с конкретных генных делеций в индуцируемой синтазы оксида азота (Inos), GP-91 phox (NADPH-оксидаза) и Специфический иммунитет, связанных с GTPases (IRGs). Это позволит определить, если выявленные паразитов гены важны для устойчивости к окиси азота, реактивных промежуточных кислорода или иммунитет, связанных с ГТФ ²⁸ соответственно, или если неизвестно иммунный механизм участвует. Активация макрофагов инфицированных как с IFN-γ и ЛПС, описанных в данном протоколе, приводит, прежде всего, в изоляции генов, важных для резистентности паразита к окиси азота ^28. Использование фармакологических агентов, которые индуцируют оксида азота в отсутствие активации макрофагов (доноры оксида азота) подтвердил, что большинство генов, идентифицированных имеют важное значение для повторногопомощь в разработке оксида азота, а не окиси азота в концерте с дополнительными посредников, связанных с активацию макрофагов ^28.

Шаг один и два описания вперед экран генетики разработанный, чтобы изолировать паразита мутантов с фитнес-дефекта следующей активации мозга, полученных макрофагов инфицированных костных в пробирке. Шаг один описывает анализ титрования дозы эмпирически определить дозу IFN-γ и ЛПС использовать для активации макрофагов, что снижает паразитную репликацию, но не полностью ингибировать репликацию дикого типа T. гондий родительский штамм, который используется для создания библиотеки паразитов мутантов. Шаг два описывает генетическую вперед экран мутантных клонов в макрофагах в 96-луночных планшетах. Шаг третий описывает подход, чтобы подтвердить фенотип каждого мутанта, указанного в экране луночных планшетах 96 и оценить, влияет ли дефект в каждом мутанта выживание паразита, репликацию,или производства киста в ответ на активацию макрофагов. Шаг четыре описывает использование мозга, полученных от макрофагов костей мышей с делеций в конкретных антимикробных путей для выявления иммунные медиаторы, к которому паразит мутант специально чувствительны. Шаг пятый очерчивает подход для определения, если паразит мутант также угрозу для патогенеза в естественных условиях, как оценивается производства кисты в мозге зараженных мышей.