正向遗传学屏风使用巨噬细胞识别<em>弓形虫</em>基因的重要的抗IFN-γ依赖性细胞免疫自主

弓形虫（弓形虫）是一种专性细胞内，原虫病的病原体。这是弓形体病的病原体，免疫功能低下的个体健康危险。这也是其他顶复门病原体感染人类，包括隐孢子虫和模型系统。弓形体病是通过食物或水沾染寄生虫的缓殖子或卵囊阶段摄入最常获得的。一旦摄入，这些阶段转换为复制的宿主细胞内，并系统地传播寄生虫的速殖子阶段。 T细胞，IFN-γ和，在较小程度上，一氧化氮^1-4，是用于控制感染重要的，但不能够消除疾病，如速殖子的比例转换为被组织囊肿内保护缓殖子阶段产生一个长寿命的慢性感染。事实上，还没有治疗剂有效对抗慢性囊肿s踏歌疾病。严重弓形体病是最常见的是由于持续感染的再活化，与寄生虫转换回的初级和急性感染迅速复制速殖子阶段特性的缓殖子阶段。

早生存于先天免疫应答的面是非常重要的，以允许寄生虫达到足够寄生虫数目，以及到达末端位置，以使建立慢性感染的T。弓形虫已经发展战略，以抵消可能的复制和传播感染的早期能力有助于宿主的防御机制。首先，T.弓形虫形成寄生虫入侵期间的唯一的PV是从该宿主细胞的相比其他细胞内病原体^5-9内吞和胞吐过程基本上隔离。此外，像所有成功的细胞内病原体T.弓形虫修改它的宿主细胞创造一个宽松的环境˚F或生长。这包括重编程的宿主细胞的基因表达，通过改变宿主细胞的转录因子包括那些用于调节细胞活化^10-15重要。 ROP16 ^16-19 GRA15 ^{20，GRA16 21}和GRA24 ²²都被证明在调节转录反应和细胞信号感染T.宿主细胞的级联是重要弓形虫 。使用寄生虫株不同的表型之间的遗传杂交最近的研究已经查明背后的寄生虫基因相关的性状，包括免疫相关的GTP酶^{（IRGs）16,19,23-26}逃避寄生虫基因高产。在小鼠中，免疫相关GTP酶（IRGs）是用于第二类型的控制和III基因型寄生虫的临界而很毒的I型基因型已经进化机制以逃避鼠IRGs。然而，同样明显的是寄生虫已经进化机制以逃避抗菌媒体除了​​IRGs和一些这些机制器可跨越寄生虫基因型^27,28保守的。此外，很少有人知道的细胞自主免疫力T.关键调解人人类弓形体病弓形虫期间。寄生虫基因抗性的细胞中自主免疫介重要也可以是用于生存重要期间速殖子要缓殖子转换其也可以通过宿主的免疫反应引起的。例如，一氧化氮在高的水平，可以抑制在受感染的巨噬细胞寄生虫复制，但它也可以刺激速殖子至缓殖子转变导致囊肿生产^30-32。

ToxoDB是一种功能性基因组数据库T.弓形虫充当对字段中提供的序列信息用于寄生虫的基因组，并获得公布和未公布的基因组尺度的数据包括社区注解方面的重要资源，基因EXP ression和蛋白质组学数据^33。类似于许多原虫病原体，多数基因组由基于基因同源性为深入了解其潜在功能可以假设基因，没有信息。因此，正向遗传学是一种强大的工具，以确定新的寄生虫基因免疫逃避，囊肿转换等功能为寄生虫的发病机制，以及对不同的发育阶段之间的转换关键重要。正向遗传学的附加优点是，它可被用作一个相对无偏见的方式来询问寄生虫为那些对在发病特定的任务，包括免疫逃避和囊肿形成重要的基因。在新一代测序的突变分析近期的改进，使它的首选识别从正向遗传学研究的负责疟原虫基因用化学方法和插入突变^34-37的方法。

ntent“>重要的是要确定在弓形虫漏洞可以被利用以提高的细胞中自主免疫机制对寄生虫特别是那些也可以有效对抗耐药囊肿阶段。为了实现这一目的， 在体外鼠的效力是很重要的巨噬细胞的感染和激活模型的开发是为了确定特异性削弱弓形虫健身以下活化感染的巨噬细胞，但不是在幼稚的巨噬细胞的寄生虫的突变。该巨噬细胞的屏幕被用于询问弓形虫插入突变体文库，以最终识别弓形虫基因抗性很重要的一氧化氮^27,28。 弓形虫突变体活化感染的巨噬细胞，特别是一个显着的敏感性，一氧化氮的受损性的面板的分离，证实在屏幕的效用，以确定寄生虫基因性重要到的细胞中自主免疫比鼠IRGs ²⁸中描述的抗性机制的其他介质。插入突变有超过化学诱变优点在产生的随机突变在每个寄生虫克隆和，在理论上，便于识别突变位点的数量有限的条款。然而，确定质粒插入的T.的基因组位点弓形虫插入突变体，在实践中，已经令人惊奇地难以在许多情况下^，37。一个质粒导入的基因的插入也有可能打乱一个基因的功能在对比化学诱变通常导致单核苷酸变化。然而，化学诱变是N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）或甲磺酸乙酯（EMS），可以提供分析寄生虫基因组的较大部分增加的能力，相对于插入诱变，因为它创建多个单核苷酸多态性（每突变体³⁴估计为10 -100）38。此外，在全基因组谱的最新进展使得有可能使用下一代测序，以确定负责突变寄生虫^34,38的所识别的表型是最有可能的候选基因。不管诱变方法，确认该寄生虫基因抗性巨噬细胞活化中的作用的最终需要的基因缺失和互补履行分子柯赫氏法则。

解剖的基因通过两个寄生虫和巨噬细胞的遗传操作的功能的能力是重要的，因为许多经由正向遗传学T中鉴定的基因的弓形虫，以及其它病原体，仍然表征为假想的基因几乎没有序列同源性的其他蛋白与已知功能。当前文件概述了可被用于识别在一个突变体被破坏的基因是否是用于抵抗重要到一个已知的或一般的做法未知调解员的细胞自主的免疫力。通过评估野生型和从野生型小鼠与那些与诱导型一氧化氮合酶（iNOS），GP-91 PHOX（NADPH氧化酶）特异性基因缺失突变体的巨噬细胞的寄生虫的存活进行的宿主抗微生物因素最初的分析，并特异性免疫相关的GTP酶（IRGs）。这将确定是否所识别的寄生虫基因是抗一氧化氮，活性氧中间体或分别或者如果未知免疫机制参与免疫相关GTP酶²⁸重要。受感染的巨噬细胞与这两种IFN-γ和LPS，在当前协议中描述的活化，导致主要在寄生虫基因抗性很重要的一氧化氮²⁸的隔离。采用药理学试剂诱导的一氧化氮在没有巨噬细胞活化的（一氧化氮供体）证实，大多数鉴定的基因的人重新重要sistance一氧化氮，而不是一氧化氮的音乐会与巨噬细胞活化²⁸相关的其他调解员。

步骤1和2描述了一个向前遗传学屏幕旨在隔离寄生虫突变体与健身缺陷以下体外活化感染的骨髓衍生巨噬细胞。步骤1描述了一个剂量滴定分析来凭经验确定IFN-γ和LPS的剂量用于巨噬细胞活化，减少寄生虫复制，但不能完全抑制野生型T的复制弓形虫父母菌株用于创建寄 ​​生虫突变体库。步骤2描述了突变体克隆在96孔板的巨噬细胞的前向遗传屏幕。步骤3概述的方法来确认鉴定在96孔板的屏幕，并评估在每个突变体中的缺陷是否影响寄生虫存活，复制每个突变体的表型，或囊肿生产响应于巨噬细胞的活化。步骤4描述了使用骨髓衍生的巨噬细胞的小鼠与特定抗微生物途径缺失来识别免疫介质到的寄生虫突变体是特别敏感的。步骤5概述的方法，以确定是否一个寄生虫突变体也遭到了破坏用于体内发病如在感染小鼠的脑中评价由囊肿的生产。