Double étiquetage des cellules de la crête neurale et des vaisseaux sanguins dans des embryons de poulet à l’aide de la greffe de tube neural^{Chick GFP} et de l’injection de diI de colorant de carbocyanine

1. Préparation du micro-scalpel pour les ablations du tube neural Façonner un micro-scalpel à partir d’une aiguille à coudre en acier disponible dans le commerce. Aplatir d’abord l’aiguille des deux côtés à l’aide d’une meule montée sur une meuleuse de banc motorisée. Commencez à façonner le scalpel, d’abord sur une pierre de l’Arkansas de qualité grossière en utilisant un mouvement circulaire contrôlé, dans des directions alternées, des deux côtés de l’aiguille. Continuez les mêmes mouvements d’affûtage sur une pierre arkansas de qualité extra fine pour façonner un micro-scalpel ultra fin, avec un tranchant bien défini(Figure 1A, B).REMARQUE: Les alternatives au micro-scalpel pourraient être des aiguilles électrolitiquement aigugées, des aiguilles de tungstène disponibles dans le commerce ou des aiguilles en verre tirées. 2. Incuber les œufs de type sauvage et de GFP jusqu’au stade souhaité Entreposer les œufs de poule fertilisés et les œufs de poule GFP transgéniques dans un incubateur refroidi à une température de 14 à 15 °C avant l’incubation, car le développement est arrêté à cette température. Conservez les œufs pendant quelques jours, jusqu’à une semaine. Pour commencer le développement, placez horizontalement les œufs de type sauvage et de GFP sur un plateau et incuber simultanément dans un incubateur à 37,5 ºC, de sorte que les embryons sont aux stades correspondants pour la greffe de tube neural. Pour obtenir des embryons au stade de développement de 10 à 12 somite pour effectuer une greffe de tube neural vagal, incuber des œufs pendant 1,5 jour (33 à 38 heures) et mettre au stade des embryons selon les tables de développement de Hamburger et Hamilton21. 3. Préparer les œufs pour le fenêtrage et la greffe Déplacez un œuf à la fois vers un porte-œufs sur mesure pour le fenêtrage. Faites un petit trou dans la coquille de l’œuf en tapotant à plusieurs reprises, avec des ciseaux droits, sur la surface supérieure de l’extrémité pointue de l’œuf. Retirer 2 à 3 ml d’albumine de l’œuf avec une aiguille hypodermique de 181/2 G et une seringue de 5 ml. Le retrait de l’albumine abaisse le jaune dans l’œuf et facilite le fenêtrage ultérieur sans causer de dommages à l’embryon. Jetez l’albumine. Scellez le trou avec une petite bande de ruban adhésif clair coupé à la taille avec de fins ciseaux. À l’aide de ciseaux incurvés, percez un autre trou dans la surface supérieure de la coquille d’œuf. Insérez la pointe des ciseaux dans le trou et, en gardant les ciseaux parallèles au banc, travaillez dans un mouvement circulaire pour couper une fenêtre d’environ 2 cm de diamètre sur le dessus de la coque. Gardez les ciseaux en position stationnaire et faites pivoter l’œuf. Jetez le disque retiré de la coquille d’œuf. À E1.5, l’embryon est reconnaissable comme un disque jaune plus foncé sur le jaune. Enlevez tout débris de coquille qui est tombé dans l’œuf à l’aide d’une pince à épiler. Jetez tous les œufs non fécondés (identifiés par une petite tache blanche sur le dessus sur le jaune clair). 4. Préparer l’embryon hôte à recevoir du tissu greffé Ajustez le stéréomicroscope au niveau des yeux et optimisez l’orientation de la source de lumière à col de cygne pour éclairer adéquatement l’embryon sans provoquer de réflexions. Pour visualiser l’embryon proprement dit,injectez une petite quantité d’encre de Chine sous le centre du disque jaune plus foncé, à l’aide d’un tube buccal et d’une micro-pipette en verre tiré(Figure 1C, Oii). Préparer l’encre 50:50 avec du PBS contenant de la pénicilline/streptomycine à une concentration finale de 100 μg/ml. Insérez la micro-pipette à travers la membrane jaune à l’extérieur du périmètre du blastoderme puis inclinez soigneusement sa pointe directement sous l’embryon. Délivrez de l’encre sous l’embryon en soufflant sur le tube buccal. Si le pipetage par la bouche n’est pas autorisé, utilisez plutôt une seringue de 1 ml. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air sous l’embryon, ce qui peut entraîner une contamination, puis retirez soigneusement la micro-pipette en verre. Il s’agit d’une étape délicate qui peut entraîner la mort de l’embryon si elle n’est pas effectuée avec précision. Étagés l’embryon par référence à Hamburger et Hamilton21 et enregistrer l’étape dans un livre de laboratoire. À l’aide d’un micro-scalpel sur mesure (ou d’une aiguille de tungstène fine) monté sur un porte-aiguille, faites un très petit gaz dans la membrane vitelline, à côté de la zone où la micro-chirurgie sera effectuée. Appliquez soigneusement 2 à 3 gouttes de PBS sur la déchirure de la membrane (à l’aide d’une micro-pipette en verre et du tube buccal) pour créer de l’espace entre l’embryon et la membrane. Coupez une fenêtre plus grande dans la membrane pour exposer toute la région où la micro-chirurgie aura lieu. Retirez la région du tube neural d’intérêt à l’aide du micro-scalpel, en commençant par des incisions transversales rostrales et caudales sur l’ensemble du tube neural dorsal (au niveau de somite 1 à 7 dans la vidéo). Couper bilatéralement entre le tube neural et les somites pour séparer le tube neural des tissus environnants, sans endommager les somites. Séparez très doucement le tube neural du notochord sous-jacent, qui doit rester intact. Notez que l’excision réussie du tube neural laissera tous les tissus environnants parfaitement intacts (Figure 2). Retirez le tube neural excisé en l’aspirant dans une micro-pipette en verre, puis jetez-le. Notez le niveau d’ablation du tube neural dans un livre de laboratoire. L’embryon hôte est maintenant prêt à recevoir le tube neural du donneur. 5. Préparer le tissu greffé donneur Sélectionnez un embryon GFP fenêtré et apparié par scène en le visualisant sous un stéréomicroscope fluorescent avec filtre FITC. La fluorescence GFP permet de visualiser très facilement les somites et de mettre en scène l’embryon. Une fois qu’un embryon apparié au stade a été identifié, retirez l’embryon de l’œuf en faisant 4 incisions, avec des ciseaux à ressort Pascheff-Wolff (Figure 1C, l) dans une forme rectangulaire autour de l’embryon, puis ramassez-le doucement avec une cuillère à embryon. Placez l’embryon dans un verre de montre carré avec une base en polymère sylgard. Secouez doucement l’embryon avec du dumont #5 pince à épiler pour enlever tout jaune attaché. Retirez la membrane vitelline et épinglez l’embryon sur la base en polymère à l’aide de broches minutien en acier inoxydable(Figure 1C). À l’aide des ciseaux à ressort, faites 4 incisions de forme rectangulaire autour du tube neural et des somites environnantes, dans la même région qui a été retirée de l’embryon hôte. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférer le tube neural et les tissus somites de l’embryon GFP du donneur dans un verre de montre contenant 0,2% de pancréatine dans le PBS Pen/Strep. Laisser la digestion enzymatique se poursuivre pendant 10 min à TA pour aider à séparer les tissus. Après incubation en enzymes, utilisez des broches minutien en acier inoxydable montées sur une poignée pour séparer manuellement le tube neural de tous les tissus adjacents. À l’aide d’une micro-pipette en verre, transférer le tube neural dissocié vers un autre verre de montre contenant du DMEM + 10% de sérum(p. ex.chèvre, cheval ou veau fœtal) sur de la glace, pour rincer l’excès de pancréatine et arrêter la digestion enzymatique. Après 5 min, le tube neural disséqué est prêt à être greffé orthotopiquement dans l’hôte poussin(figure 2 et S1). 6. Greffer le tissu À l’aide d’une micro-pipette en verre, transférez soigneusement le tube neural disséqué du verre de la montre à l’embryon hôte. Placez le tube neural dans l’orientation antérieure-postérieure correcte et poussez doucement l’explant adjacent à la région excisée de l’hôte poussin à l’aide du micro-scalpel. Laissez un petit fragment d’ectoderme attaché à la surface dorsale ou en coupant une petite entaille pour identifier l’orientation du tube neural. Si nécessaire, utilisez le micro-scalpel pour couper l’explant à la taille exacte de la région excisée. Guidez doucement le tube neural dans la région ablated et positionnez-le de telle sorte que le côté dorsal soit correctement orienté. Utilisez une micro-pipette en verre, montée sur un tube buccal, pour enlever le PBS et/ou le liquide entourant le greffon. Cela aide le donneur et les tissus de l’hôte à adhérer et le greffon à s’établir. Scellez toute la fenêtre avec du ruban adhésif clair de 24 mm de large pour éviter la déshydratation et la contamination. Étiquetez l’embryon chimérique en le marquant avec un crayon sur la coquille d’œuf et notez son numéro dans le livre de laboratoire. Retournez l’œuf à l’incubateur pour un développement ultérieur. 7. Injecter diI dans les vaisseaux sanguins de l’embryon hôte Au moment expérimental souhaité (ici, 3 à 10 jours plus tard), récupérez l’embryon chimérique de l’incubateur et retirez le ruban clair à l’aide de ciseaux droits pour accéder à l’embryon dans l’œuf. Si nécessaire, agrandissez la fenêtre dans la coque à l’aide des ciseaux. Veillez à ne pas endommager la membrane chorioallantoïque si elle est fixée à la coquille, ce qui entraînerait une hémorragie et compromettrait l’étiquetage des vaisseaux sanguins. Choisissez une veine accessible sur le jaune en vous assurant que le flux sanguin est dirigé vers l’embryon. Choisissez un point de ramification de l’une des veines vitellines(figure 3B, C).REMARQUE: À E6.5 – E7.5, la membrane chorioallantoïque peut devoir être doucement écartée avec une pince à épiler pour accéder aux veines jaunes. Après E8.5, la seule option est d’injecter dans l’une des veines membranaires chorioallantoïques puisque, à ce stade, la membrane chorioallantoïque recouvre entièrement l’embryon. Retirez la membrane vitelline au-dessus du point d’injection choisi à l’aide de deux pinces Dumont #5 en la déchirant dans des directions opposées. Cassez une aiguille de verre tirée à l’aide d’un #5 Dumont et ajustez son diamètre à la taille approximative de la veine avant le chargement avec CellTracker CM-DiI. Faire la solution mère DiI à 40 μg/μl dans du DMSO et conserver à -20 °C. Préparer la solution de travail dans du saccharose/PBS 0,3 M à une concentration de 4 μg/μl. Aspirer entre 5 et 10 μl de DiI dans 0,3 M de saccharose/PBS dans l’aiguille à l’aide de l’aspiration avec un tube buccal. Les embryons plus âgés peuvent nécessiter jusqu’à 25 μl ou plus. À partir de E8.5, les embryons ont des veines plus grandes et plus musclées, qui peuvent avoir besoin d’être maintenues en position avec un #5 Dumont avant de poignarder avec l’aiguille de verre chargée de DiI. Insérez rapidement l’aiguille dans la veine et soufflez régulièrement avec le tube buccal pour permettre au DiI de rejoindre le flux sanguin lentement sans former de caillot. Vous pouvez également utiliser un injecteur de pression pour la livraison diI. 8. Prélever des embryons à des fins de sectionnement ou d’examen de montage entier Pour conserver autant de DiI dans l’embryon que possible, prélever l’embryon immédiatement après l’injection en le ramassant sur une cuillère perforée et en coupant les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs avec une paire de ciseaux droits, pour libérer l’embryon du jaune. Retirez toutes les membranes lâches et disséquez les organes d’intérêt(c’est-à-direles poumons et le tube digestif dans ce tutoriel), en prenant grand soin de ne pas comprimer le tissu, ce qui crée une diffusion du DiI. Fixer immédiatement les tissus par immersion dans 4% PFA pendant 1 – 2 heures à RT. Rincer le tissu pendant 5 min dans du PBS, puis 15 min dans du PBS contenant 5 μg/ml de DAPI. Montez les échantillons sur une lame de microscope pontée pour l’examen de la monture entière ou intégrez-les pour la cryo-sectionnement.