We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.
The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer’s attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.
Den immunologiske synapse (IS) ligger i en kritisk fase for celle aktivering og funktion 1. Det er det primære medium, som antigenpræsentation og cellemedieret immunitet udføres. De tidligste mikroskopiske undersøgelser af synapsedannelse udnyttede en celle-celle-konjugat systemet 2. Den største begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at de fleste af konjugaterne vil blive set 'i profil ", som det var, og begrænser dermed observatørens visning af synaptiske selve strukturen. I 1999 Dustin laboratorium rettet denne begrænsning ved at anvende glas-understøttet lipiddobbeltlag (SLB) teknik 3, som var blevet banebrydende tidligere af McConnel laboratoriet 4,5. Denne tilgang bortskaffes antigenpræsenterende celler (APC'er) til fordel for et glas-støttede plane lipid overflade, i hvilke proteiner kan knyttes og bevæge sig frit i to dimensioner. Ved hjælp af denne metode, Dustin og kolleger var i stand til at peer direkte op i than Synapse hjælp af høj opløsning fluorescensmikroskopi og for første gang får en "face-to-face" se på strukturen af IS.
Med brugen af SLB systemet har detaljer, som IS kan visualiseres blevet begrænset kun af de begrænsninger af nuværende billeddannelsesteknikker 6-8. Brug standard Belysningsteknik, det minimum opløsning (dvs. mindste afstand mellem to forskellige objekter, hvor de kan skelnes) har været <200 nm på grundlag af Rayleigh kriterium 9. Denne grænse hindrer billeddannelse af meget fine, molekylær skala strukturer, der udgør synapsen, og indtil udviklingen af super-opløsning billeddannelse teknikker 10-12 blev visualisering af disse strukturer begrænset til billeddannelse af fikserede celler ved anvendelse af elektronmikroskopi.
Med den seneste fremkomsten af en række super opløsning teknikker, såsom SIM-kort (struktureret belysning mikroskopi), PALM (fotoaktiveret lokalisering mikroskopi), STORM (stokastisk optisk genopbygning mikroskopi), og STED 10-12, efterforskere er nu i stand til at studere disse synaptiske strukturer i hidtil uset detalje, som har til gengæld, forudsat en stadig afklaret forståelse af IS. Fordelene ved STED mikroskopi er blevet beskrevet før den 13.. Her beskriver vi super-opløsning billeddannelse med STED mikroskopi udstyret med den nyudviklede 660 nm udtynding laser. Sammenlignet med konventionelle 592 nm udtømning laser, 660 nm laser giver mulighed for en bredere udvalg af fluorescerende farvestoffer (se http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), især disse røde fluoroforer.
Andre publikationer har beskrevet STED billeddannelse af NK-celle synapser på antistof-coatede objektglas 13,14. Her er SLB kombineret med super opløsning STED mikroskopi at studere NK-celle synapse. Denne teknik har den fordel i forhold til antistof-coatede objektglas for at være en fluid mosaik, hvor de indlejrede overfladeproteiner kan bevæge sig frit i en flad todimensional overflade (xy planet). Dette efterligner mere trofast den organiske og mobile overflade af et mål celle, og dermed bedre rekapitulerer dannelsen af en fysiologisk relevant immun synapser.
Målet med denne protokol er at give slutbrugeren med en detaljeret beskrivelse af, hvordan billedet den immunologiske synapse af NK-celler ved at kombinere SLB-systemet og super opløsning STED mikroskopi. Det vil give slutbrugeren med de nødvendige trin: forberede liposomer, konstruere protein-embedded dobbeltlag, fastlægge protein tæthed på lipiddobbeltlagene, og erhverve billeder super-opløsning ved hjælp STED mikroskopi. Disse teknikker er ikke begrænset til området for immunologi og kan anvendes bredt på tværs af en række forskellige discipliner.
Det nye ved den aktuelle undersøgelse er, at den kombinerer SLB teknik med STED at studere NK celle synapser. Tidligere undersøgelser har afbildet lipiddobbeltlaget med TIRF at studere T-celle synapsedannelse 8 og signalmolekyle handel på plasmamembranen 6. Andre har beskrevet STED billeddannelse af NK-celle synapser under anvendelse af antistof-overtrukne objektglas 13,14. Den heri beskrevne yderligere hybrid metode bygger på disse bestræbelser ved billeddannelse af NK-celle synapse med forstærket klarhed ydes af super-resolution imaging på lipiddobbeltlaget overflade, som bedre modeller den dynamiske overflade af en APC.
Selvom SLBs er kunstige membraner mangler af cytoskelet, lipidklumper og andre ligander, at de faktiske target celler eller APC'er besidder, kan denne teknik rekapitulere vigtige funktioner såsom mobilitet og orienteringen af ligander. Dette gør det muligt SLB systemet til at fungere som en reduktionistisk tilgang dissekere tHan bidrag enkelte receptorer og ligander til dannelse af IS og dynamikken i ER. Det vigtigste element i SLBs er, at forskerne kan kombinere denne teknik med høj opløsning billedteknik, såsom konfokal og TIRF mikroskopi. Indførelsen af STED mikroskopi yderligere øger denne fordel, der giver hidtil usete indsigt i, er forskning og kliniske anvendelser.
En potentiel kritik af dette system er, at SLB ikke i tilstrækkelig grad efterligner den komplekse overflade af en APC, hvilket giver anledning til potentielt ikke-fysiologiske anatomiske træk i de resulterende synapser. Selv om det er rigtigt, at den begrænsede repertoire af overflademolekyler på SLB ikke fuldt rekapitulere heterogent befolkede overflade af en APC, kan denne grænse også være fordelagtigt, at den gør det muligt for forskere at bestemme indflydelsen af individuelle receptor og ligand-interaktioner på synapsedannelse .
Ther er flere afgørende skridt i processen. Blandt de mest kritiske er, at oxidation af liposomerne forhindres gennem konstant med argon at fortrænge oxygen i røret og opløsning, såsom i trin 1.10, 2.6 og 2.11. Oxidation af lipider vil resultere i nedsat lipid mobilitet og dermed bringe evne overfladeproteiner at bevæge sig frit og deltage i synaptisk strukturering. Ligeledes er det også afgørende at fjerne alle de chloroform i liposomet ved frysetørring (trin 1.2). Ved bestemmelsen af protein tæthed i lipiddobbeltlaget, er det vigtigt først at dispergere silicium perler til en homogen suspension fri klynger. Om nødvendigt kan anvendes lydbehandling af perler. I samle SLB de tidlige trin (5,1 til 5,8), hvor dækglassene rengøres, dråberne er placeret, og dækglas anbringes er afgørende. En fejl i nogen af disse kan nødvendiggøre at starte eksperimentet derover (fra begyndelsen af afsnit 5). Af denne grund er detskal rengøres flere dækglas, end der vil være behov for at spare tid i tilfælde af et uheld.
Ikke-klyngedannelse er den hyppigste problem, når man arbejder med dette system. Hvis der, når visualisere cellerne i det sidste trin, man ikke kan finde fluorescerende synapser, der er et par skridt, der kan tages. En anden plet for beslægtede celleoverfladereceptor kan tilsættes til kammeret for at kontrollere, at cellen ikke har dannet en synapse med dobbeltlaget, mens celler kan klæbe uspecifikt til dækglas eller dobbeltlag overflade, synaptisk-involverede overfladeproteiner bør vises som adskilte klynger på planet af celle-dobbeltlag interface, mens uengagerede overfladeproteiner skal vises som diffus farvning omkring omkredsen af cellen. Hvis denne metode mislykkes, bør man kontrollere deres celler via flowcytometri for at sikre, at den pågældende markering man håber at undersøge udtrykkes i passende overflod på celleoverfladen. Visse overflade proteins er kendt for at være nedreguleret på lang sigt in vivo kultur.
Mens denne protokol detaljer specifikt, hvordan at visualisere NK-celle synapsedannelse kan SLB systemet anvendes til at studere synapsedannelse i en immunocyt tænkelige blot ved substitution af den primære ligand i trin 5.11. Flere ligander kan også tilsættes samtidigt. Man behøver heller ikke bruge et streptavidin-biotin-system til at klæbe overfladeproteiner i dobbeltlaget. Nikkel-NTA: histidin interaktioner er også levedygtige. Men på grund af den høje styrke og specificitet af streptavidin: biotin interaktion, vores laboratorium foretrækker dette system. Man kan også variere koncentrationen af celler tilføjet på dobbeltlaget fra den foreskrevne densitet i trin 5.13, samt varigheden af den efterfølgende inkubationsperiode for at observere synapser på forskellige stadier af modning. Dette kan endda gøres levende, selv om dette naturligvis udelukker visualisere intracellulære structures (medmindre de allerede er mærket med en fusioneret fluorescerende tag; vores laboratorium bruger nogle af disse ændrede cellelinjer). På grund af den høje grad af tilpasning muligt i denne protokol, kan man bruge den grundlæggende SLB teknik, sammen med STED billedbehandling, for at løse en utrolig bred vifte af spørgsmål i immunologi, cellebiologi og biokemi, herunder grundlæggende lipid dynamik 15, synapsedannelse 16, intracellulær signalering 17 og tumorcellemetastase 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Purpose |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
25×75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |