Summary

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Published: February 19, 2015
doi:

Summary

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Abstract

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Introduction

La perdita di neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta conduce ai sintomi motori cardinali della malattia di Parkinson (PD), la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa. La causa della morte di questa popolazione neuronale mesencefalica non è nota. Per studiare i meccanismi biochimici responsabili dello sviluppo e modulando le proprietà neurofisiologiche e la sopravvivenza dei neuroni mesDA, diverse colture cellulari e sistemi modello animali sono stati utilizzati. Linee cellulari immortalizzate, compreso il ratto dopaminergica linea cellulare 1RB 3 AN 27 (N27), il dopaminergico umano linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y, la linea cellulare di ibridoma del mouse dopaminergica MN9D e mesencefalico umana LUHMES cellule sono state usate per gli studi meccanicistici biochimici e limitate 1 -5. Per lo studio della perdita di neuroni specifica mesDA, vari neurotossina-based e modelli genetici sono stati sviluppati 6-8. Culture mesencefalo ventrale primarie, Fornire uno strumento indispensabile per lo studio delle proprietà neuronali e sinaptiche dei neuroni dopaminergici e i meccanismi coinvolti nella patogenesi di questa malattia comune.

Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei neuroni dopaminergici mesencefalici, che contiene le modifiche con conseguente maggiore sopravvivenza e una maggiore resa di vetrini per dell'embrione. L'uso di pre-maturo mesencefalo del mouse E12.5 (E14.5 nel ratto) migliora la sopravvivenza. A questa età i neuroni non hanno ancora sviluppato assoni, che lascia intatte le cellule durante la dissezione e riduce al minimo lo stress incrementando in modo significativo la redditività. Inoltre, attenta dissezione del mesencefalo ventrale, come descritto nella sezione 2 del presente protocollo, migliora ulteriormente la capacità di sopravvivenza. Per aumentare il numero di vetrini per embrione, un metodo alternativo di placcatura è presentato nella sezione 4 del presente protocollo. Questo porta ad un rendimento di fino a 10 vetrini per dell'embrione rispetto a 4 coprioggetti sottocondizioni standard di placcatura riducendo così la quantità di animali per esperimento.

I neuroni in coltura mostra conseguenza di assoni e dentrites, formano connessioni sinaptiche e rivelano la presenza di marcatori neuronali e sinaptiche rendono queste culture adatto per l'imaging cellulare dal vivo, immunocitochimica e studi elettrofisiologici. Inoltre, l'uso di colture neuronali facilita la manipolazione genetica e farmacologica. Escrescenza dei neuriti dal giorno 2 in vitro consente per gli studi di sviluppo. Inoltre, la sopravvivenza a lungo termine di culture (fino a sei settimane) li rende adatti per lo studio della lenta, progressiva degenerazione dei neuroni questi.

Protocol

NOTA: Gli animali sono stati mantenuti e gestiti in conformità con le linee guida istituzionali e tutte le procedure di animali sono stati approvati dal benessere degli animali del Imperial College e Ethical Review Body (AWERB) e il Ministero degli Interni e la Harvard University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC), in conformità alle normative federali e statali. 1. reagente e installazione attrezzature Thaw, aliquota e conservare 1 mg / ml soluzione laminina a …

Representative Results

Immunoistochimica contro tirosina idrossilasi (TH) mostra che tra 0,5-1% delle cellule in coltura sono dopaminergica. Proiezioni neuronali sembrano in 2 ore dopo la placcatura e il primo giorno, assoni e dendriti sono distinguibili (figura 2), utilizzando la tirosina idrossilasi (TH) e proteina 2 (Map2) anticorpi associata ai microtubuli (Figura 3). I neuroni sopravvivono per più di sei settimane e mostrano un'ampia conseguenza. Il rapporto neurone-glia nelle colture è direttament…

Discussion

Neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono la principale fonte di dopamina nel sistema nervoso centrale. Sono divisi in tre gruppi, pars compacta della sostanza nera (SNPC), area ventrale tegmentale (VTA) e campo retrorubral (RRF) 10, 11. I neuroni in SNPC e VTA danno luogo a grandi vie dopaminergiche, mesocorticali, mesolimbico e nigrostriatale, coinvolte in funzioni come il controllo delle emozioni, la motivazione e il comportamento del motore. Scomparsa dei neuroni in SNPC e disgregazione funzionale del si…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 Invitrogen 11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid Invitrogen 24020-117)
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) Invitrogen 16140
N2 Supplement (100X), liquid Invitrogen 17502-048)
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water Sigma G8769
Bovine serum albumin BSA Sigma A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070
Trypsin (0.05% (wt/vol) Invitrogen 25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested Sigma  A9418
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody Pel-Freez Biologicals P60101-0 
Poly-L-ornithine, 0.01% solution Sigma P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody Millipore MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody Millipore AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody Molecular Probes A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody Molecular Probes A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody Molecular Probes A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody Molecular Probes A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody Molecular Probes A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) Biowhittaker 17-942E
Stereo Microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope Carl Zeiss Axiovert 40 C
Dumont Forceps Fine Scientific Tools May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel Fine Scientific Tools 11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel Fine Scientific Tools 11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm Fine Scientific Tools 10052-11
Student Iris Scissors – Straight 11.5cm Fine Scientific Tools 91460-11
Fiber optic halogen illuminator Nikon MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20C
Hemocytometer Proscitech SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units Nalgene NL-CE-156-4020
100x20mm Petri dishes BD Biosciences 351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm Bellco Glass 1943-10012 

Referências

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Citar este artigo
Weinert, M., Selvakumar, T., Tierney, T. S., Alavian, K. N. Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains. J. Vis. Exp. (96), e52475, doi:10.3791/52475 (2015).

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