JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

Published: January 19, 2015
doi:
10.3791/52474
, , ,
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences,University of Padova, 2The RNA Institute,SUNY Albany

Summary

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Abstract

RNA או DNA המקופל בקיפול tridimensional היציב הם מטרות מעניינות בפיתוח אנטי-סרטני או תרופות אנטי. במקרה של HIV-1, חלבונים נגיפיים המעורבים בוויסות של פעילות הווירוס מזהים כמה חומצות גרעין. חלבון nucleocapsid NCp7 (NC) הוא חלבון עיקרי המסדיר כמה תהליכים בעת שכפול וירוס. NC הוא למעשה מלווה לערער את יציבות מבנים משניים של RNA ו- DNA והקלת חישולם. איון של NC הוא גישה חדשה ומעניין ליעד טיפול אנטי HIV. N ucleocapsid M nnealing- ediated lectrophoresis E assay (שם) פותח כדי לזהות מולקולות מסוגלת לעכב את ההיתוך וצריפה של RNA ו- DNA המקופל בתצורות tridimensional יציבים thermodynamically, כגון מבני סיכת ראש של TAR ואלמנטי cTAR של HIV, על ידי חלבון nucleocapsid של HIV-1. הבדיקה החדשה מעסיקה או מחדשcombinant או החלבון הסינתטי, וoligonucleotides ללא הצורך בתיוגם הקודם. ניתוח התוצאות מושגת על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית ג'ל polyacrylamide (עמוד) ואחריו מכתים חומצות גרעין קונבנציונלי. הפרוטוקול דיווח בעבודה זו מתאר כיצד לבצע assay שם עם החלבון באורך מלא או הגרסה המקוצצת שלה חסרת תחום N-terminal הבסיסי, שני מוסמכים כמלווי גרעין חומצות, וכיצד להעריך את העיכוב של פעילות מלווה NC על ידי השחלה intercalator. יתר על כן, שם יכול להתבצע בשני מצבים שונים, שימושי כדי לקבל אינדיקציות על המנגנון המשוער של פעולה של מעכבי NC המזוהים.

Introduction

חלבון nucleocapsid NCp7 (NC) מסוג וירוס הכשל החיסוני אנושי 1 (HIV-1) הוא חלבון קטן, בסיסי הקשור באופן הדוק עם RNA הגנומי בווירוס המדבק הבוגר, ששיחק תפקיד מרכזי בתרבות נגיף כקו-פקטור בשעתוק לאחור , הכרת הגנום, ואריזה. 1-3 NC פועל כמלווה חומצות גרעין מזרזות היציבות של מבני חומצות גרעין יציבים והחישול של רצפים משלימים. פעילות חומצות גרעין צבירתה מתגוררת בעיקר בחומצות אמינו 11 תחום N-terminal תוך פעילות ערעור יציבות דופלקס כבר ממופות למבנים שלה אבץ אצבע (12-55 פפטיד). 4 החלבונים הטעונים חיובי מוריד את המחסום אלקטרוסטטי של תגובת חישול ו מגביר את הקצב שבו שני רצפים משלימים נפרדים לבוא ביחד.

חומצות גרעין המקופלות בקונפורמציה היציבה דורשות פעילות המלווה של NC לfacilitatדואר חישולם 5 הדבר חשוב במיוחד בשעתוק לאחור, שבי NC הוא קריטי באירועי העברת גדיל:. בהעברת גדיל מינוס, DNA תחנת גדיל מינוס, רק retrotranscribed, יש להעביר ומרותק לרצף משלים באזור R בסוף 3 'של הגנום RNA תבנית. 6 למרות שהעדיפו thermodynamically, תגובה זו אינה מתרחשת באופן נרחב בהעדר NC בשל נוכחותם של המבנה היציב של האזור מגיב הפעלת טרנס RNA (TAR) באזורי R, שחייב להיות משויך לעותק ה- DNA שלו (cTAR DNA). 7 אזורי cTAR וTAR הם, למעשה, מובנים מאוד עם קונפורמציה גזע לולאה אופיינית. חלבון NC denatures סיכות אלה, ומקדם העברת מינוס גדיל על ידי הגדלת שיעור חישול מולקולאריים בין גדילי חומצות גרעין המשלימים. המנגנון של חישול NC של TAR וcTAR נחקר ביסודיות ודהscribed כassay חישול TAR בכמה עבודות מחקר והתכנית המוצעות מתוארת בביקורות מצוינות. 8-11 בסיכום, NC מערער את המבנה השניוני של רנ"א היציב כמו TAR-RNA, מערער את המבנה המשני של הרצף משלים, cTAR-DNA שלה , ומקדם את תגובת חישול של RNA / DNA הובילה לTAR / היווצרות heteroduplex cTAR. 10,11 כתוצאה מכך, צעד גדיל-העברה בעת שכפול HIV הוא מועדף. 12

NC הוא יעד אטרקטיבי לפיתוחם של חומרים חדשים מאז ההפרעה האפשרית הנגרמת על ידי מולקולות קטנות לכיוון צפון קרוליינה הייתה לגרום לירידה של השעתוק לאחור של הגנום הנגיפי כתוצאה מפעילות NC התפשרה. 2,13 יכלו גישה זו סופו של דבר להוביל לפיתוח של תרופות אנטי-HIV מוצלחים. במהלך הקרנה לNC מעכבי 14 פיתחנו assay להסתמך על התכונות הידועותשל nucleocapsid לערער את היציבות ביעילות ובoligonucleotides המשלים לחשל. 10,11 אנחנו קראנו לזה N ucleocapsid M nnealing- ediated lectrophoresis assay E (שם). assay NAME משתמש NC לתווך בין חישול עותקים ביציבות מובנה של חומצות גרעין משלימות, במקרה של oligonucleotide המתאים לחלק הפסגה של רצף TAR-RNA עם הרצף שלה משלים DNA (cTAR) להניב TAR ההיברידי / heteroduplex cTAR . הניתוח של TAR / תגובת חישול cTAR בנוכחות NC יכול להיחקר על ידי אלקטרופורזה יליד ג'ל polyacrylamide (עמוד).

פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע assay שם כדי לחשל במהירות בטמפרטורת חדר oligonucleotides המקופל במבני סיכת ראש יציבים, כיצד לנתח את התוצאה של התגובה ופתרון בעיות אפשריות של הניסוי. תיוג הרדיואקטיבי של חומצות גרעין לא ביקש, וdetectiעל להקות oligonucleotide יכול להתבצע על ידי שיטות צביעה קונבנציונליות. Assay, שמעסיק גם את החלבון באורך מלא רקומביננטי או גרסה סינתטית קטועה של NC, מאפשר זיהוי של intercalators השחלה עיכוב NC, פעילות במיתאם עם חזק מחייב לRNA ו- DNA. 14

Protocol

1. הכנת החומר, חומצות גרעין וחלבונים חומצות גרעין החיטוי הצינורות 1.5 מיליליטר ולאחסן אותם במכל סטרילי. לבצע כל צעד באמצעות טיפים סינון סטרילי לחסל סוכני זיהום כלומר nucleases ממתכלה מעבדה. הכן טריס-HCl pH חיץ 10 מ"מ 7.5 במים שטופל DEPC ולסנן את הפתרון עם מסנן גודל 0.22 מיקרומטר נקבובית. הערה: oligonucleotide נקרא "TAR" תואמת את רצף RNA הקצר (29-mer) של 15 ואילו cTAR הוא רצף DNA שלה משלים 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3 '5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3. Solubilize שני TAR וcTAR במאגר טריס שהוזכר לעיל (1.1.2.) כדי להפוך את 100 מיקרומטר פתרונות מניות. חנות פתרון מניות cTAR ב -20 ° C (ניתן לאחסן aliquots במשך חודשים בתנאים אלה). לאחסון לטווח הארוך של RNA, לעשות 20 aliquots μl של TARפתרון מניות, לייבש כל aliquot באמצעות צנטריפוגות רכז ואקום ולאחסן אותם ב -80 ° C. טרי לפני השימוש, resuspend כל aliquot TAR במי 20 DEPC שטופל μl. הערה: aliquots העבודה TAR ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך שבועיים. חלבון NC ו( 12-55) פפטיד NC הכן את חלבון רקומביננטי NC באורך מלא כפי שדווח. 16 חנות פתרון המניות בaliquots ב -20 ° C. קבע את ריכוז חלבון המדויק עם ספקטרופוטומטר UV-Vis באמצעות מקדם הכחדה ב 280 ננומטר של 6410 M -1 cm -1. Resuspend הסינתטי (12-55) פפטיד NC בטריס-HCl 10 מ"מ pH 7.5 ולאחסן את פתרון המניות בaliquots ב -20 ° C. קבע את ריכוז הפפטיד הנכון בספקטרופוטומטר UV-Vis באמצעות מקדם הכחדה ב 280 ננומטר של 5,700 M -1 -1 סנטימטר. הערה: פפטיד (12-55) NC הושג HPLC מטוהר וlyophilized מתוך תמיסה המכילה שני שווה של כלוריד אבץ. מתחם 1 שוקל כ 1 מ"ג של מתחם lyophilized 1 באמצעות איזון אנליטיים ולפזר אותו בשיעור של 100% DMSO 100 μl, שקל בעת, כדי להשיג ריכוז גבוה (≈10 מ"מ) פתרון מניות. קבע את ריכוז המתחם המדויק על UV-Vis ספקטרופוטומטר באמצעות מקדם הכחדתה (ב354 ננומטר: 11387 M -1 -1 סנטימטר). אחסן את פתרון המניות בחושך ב -20 ° C לפני השימוש. 2. הגדרה של מכשירי ג'ל ויציקה של ג'ל כדי להגדיר את הג'ל, לשטוף שתי צלחות (אחת ארוכה ואחת קצרה) עם 70% אתנול, לתת להם להתייבש, ולאחר מכן למקם שני מפרידי 1 מ"מ בשולי הצלחת עוד הארוכים; כסה אותו בצלחת הקצרה, והקפד ליישר את שתי צלחות בתחתית. להטיל את הג'ל, פעל בהתאם להוראות הניתנות על ידי suppייר (ספקים שונים להשתמש במכשיר מעט שונה; מלחציים כריך וערימות מסופקים על ידי כל מנגנון ליהוק). בכל המקרים, להיות בטוח כי מהדק, ערימות ואטמים נקיות, ולהסיר עקבות של acrylamide עזבו ידי משתמשים קודמים. מניחים את כריך ג'ל התאסף בעמדת הליהוק ולעקוב אחר הוראות ספציפיות על ידי הספק. הערה: בדרך כלל אטם סיליקון נקי בתחתית חריץ הליהוק מבטיח חותם טוב ועוזרת למנוע דליפות בעת מזיגת ג'ל. כדי לבדוק אם קיים דליפה, לשפוך מים מזוקקים באמצעות pipet בין לוחות הזכוכית. מוסיף מים כדי למלא את הכריך ולחכות כמה דקות כדי לוודא שאין דליפות להתרחש. אם הכריך מורכב בצורה נכונה, להסיר את המים ולהכניס את נייר סינון בין שתי הכוסות לייבוש הכוסות. הסר את הנייר ועכשיו הכריך מוכן ליציקת ג'ל. יוצקים ג'ל בטמפרטורת חדר (RT, 25 ° C). מאז polyacrylamide הוא רעיל ביותר, ללבוש כפפות. שלנוג'לי הדואר רציף 12% polyacrylamide שבאינו denaturing תנאים (מקוריים) כדי לבצע assay NAME. הכן את פתרון ג'ל 12%: לערבב 12 מיליליטר של acrylamide 40% / bisacrylamide (19/1) פתרון, חיץ 10x TBE 4 מיליליטר: 24 מיליליטר המים MilliQ (10x מ"מ, 890 מ"מ Borate, EDTA 20 מ"מ טריס-HCl 890) ו . להוסיף 400 APS μl ו -50 μl TEMED מייד לפני השימוש. מערבבים את הפתרון ומהירות להשתמש pipet לשפוך את הפתרון בין לוחות הזכוכית. להציג את המסרק בין לוחות הזכוכית, הימנעות בועות. הוסף פתרון ג'ל למלא את הכריך לגמרי. בואו ג'ל לפלמר במשך 45 דקות לשעה 1. מייד לפני טעינת מדגם, להסיר את המסרק באיטיות וביסודיות לשטוף בארות במים מזוקקים. לאחר צעדי פילמור ובארות שטיפה, פעל בהתאם להוראות הספציפיות על ידי הספק למקום כריך ג'ל במנגנון ג'ל אלקטרופורזה האנכית. אם מערכת קירור היא הווה, הקפד למקם את מערכת ג'ל בcorעמדת rect של ליבת הקירור. אם המערכת נועדה להתמודד עם ג'ל יותר מפעם אחת, אבל רק אחד ג'ל יש לרוץ, לצרף כריך ג'ל כסכר חיץ לליבת הקירור בצד השני כדי ליצור את תא החיץ העליון המלא. הערה: אם הסכר לא ממוקם בצורה נכונה, החיץ העליון ידלוף אולי לעצור את ריצת ג'ל. הכן 2.5 L של TBE הפעלת מאגר (1x: טריס-HCl 89 מ"מ, 89 מ"מ Borate, EDTA 2 מ"מ) במים ללא יונים. , במרחק של 500 מיליליטר של חיץ TBE לתא החיץ העליון ויוצקים את השארית לתוך תא החיץ הנמוך. יוצקים את חיץ TBE 500 מיליליטר שנותר לתוך תא החיץ העליון. מניחים את המכסה על החלק העליון של חדר החיץ נמוך יותר, כך שינודה והקתודה נמצאות בעמדה המתאימה. חבר את ליבת הקירור, אם קיימים, לברז מים באמצעות זרנוקים. מלא את הליבה במים ברז, שיפעל כגוף קירור באלקטרופורזה, ולתת מים ברז לזרום דרך הליבה במהלך נבחריםrophoresis. Assay תיווך חישול 3. Nucleocapsid אלקטרופורזה (שם) הכנת החוצצים הכן חיץ TNMg (1x: טריס-HCl 10 מ"מ, 20 מ"מ NaCl, Mg (4 CLO) 2 מ"מ 1, pH 7.5) מים DEPC שטופל ובלסנן את הפתרון עם מסנן גודל 0.22 מיקרומטר נקבובית. הערה: מאגר TNMg יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 7 ימים. לקבלת תוצאות קיפול והחישול הטובות ביותר, אנו ממליצים על שימוש במאגרים טריים. הכן את חיץ טעינת ג'ל המכיל SDS (SDS GLB: טריס-HCl 100 מ"מ, EDTA 4 מ"מ, 50% w / גליצרול v, 2% w / v SDS, 0.05% w / v bromophenol הכחול) במי DEPC שטופל. הערה: GLB עוזר כדי לעקוב אחר כמה רחוק דגימות oligonucleotides פועלות במערכת ג'ל ומאפשר לשקוע דגימות לתוך הג'ל. תוספת של SDS לGLB היא שלב קריטי להצלחה האופטימלית של assay NAME. אם צעד זה לא הלך, זה לא ניתן להבחין להקת חומצות גרעין בgeמערכת l (איור 2). שולט הכנה לדלל באופן סדרתי פתרונות מניות oligonucleotides ולהשתמש 10 מיקרומטר פתרונות טריים להכין 10 μl של פתרון 1 מיקרומטר של TAR. הכן באותו אופן, בנפרד, 10 μl של מיקרומטר cTAR 1 במאגר TNMg 1x. מחממים כל צינור עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן מניח להצטנן לRT על מנת TAR וcTAR להניח מבני גזע בליטת לולאתם. הכן 1 מיקרומטר פתרון של TAR ההיברידי / cTAR כשליטה. לערבב 1 μl של 10 מיקרומטר TAR עם μl 1 של 10 מיקרומטר cTAR בTNMg 1x, בהיקף כולל של 10 μl. לפגל oligonucleotides על ידי חימום הצינור עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהשאיר אותה לקריר לאט לRT על מנת TAR ללחשל את הרצף המשלים שלה cTAR וכדי ליצור את TAR היברידי פעמיים תקועים / cTAR. כאשר הפתרונות הם מקוררים RT, לבצע צנטריפוגה קצר-ספין. הוסף 3 μl של GLB SDS, EAC פיפטהפתרון h בתוך צינור 3 פעמים והכניסו את הצינור על קרח. שמור את דגימות הבקרה מתמדת על קרח עד שלב הטעינה. הכנת דוגמאות לניתוח חלבון NC ו( 12-55) פעילות פפטיד NC השתמש 2.5 μl של פתרון oligonucleotide 4 מיקרומטר טרי עבור כל דגימה. תמיד להכין כמות עודפת קטנה של כל פתרון למניעת שגיאות pipetting. מקפלים 32.5 μl של 4 מיקרומטר פתרון של TAR ו, בנפרד, של cTAR במאגר 1x TNMg כפי שדווח להכנת הבקרות שהוזכר לעיל (שלב 3.2.1.). לדלל את מניות הפתרון של שני חלבוני NC ופפטיד (12-55) NC 80 מיקרומטר פתרון עם מים MilliQ. כאשר פתרונות TAR וcTAR הם מקוררים RT, לבצע צנטריפוגה קצר-ספין של שני הצינורות ולהתחיל את ההכנה של צינורות דגימות. הכן 12 0.5 מיליליטר ריק autoclaved צינורות. מניחים 3 שורות של 4 צינורות במעמד למעבדת דגימות. כל שורה מציינת בהתאמה הדגימות לנתח החלבון NC באורך מלא דואר, הדגימות ללא חלבון והדגימות לנתח (12-55) פעילות פפטיד NC. תמיד להחליף טיפים בכל עת מגיב שונה משמש. להוסיף בכל צינור 2.5 μl של TAR המקופל ו -2.5 μl של cTAR המקופל. מוסיף מים DEPC שטופל 4 μl לדגימות לניתוח NC ושל (12-55) NC. מוסיף מים DEPC שטופל 5 μl לדוגמאות האחרות. הוסף 1 μl של 80 מיקרומטר NC או μl 1 של 80 מיקרומטר (12-55) NC לדגימות ל, בהתאמה, NC או (12-55) ניתוח NC. להוסיף מייד 3 μl של GLB SDS לדגימות זמן 0 דקות (כפי שדווחו 0 'באיור 1), pipetting הפתרון בתוך צינור כל 3 פעמים, ולבסוף הכניס את הצינור על קרח. חזור על שלב זה עבור כל הדגימות והבקרה. שמור את הדגימות יציבים על קרח עד שלב הטעינה. אחרי 15 דקות, 30 דקות ושעה 1 של דגירה על RT, להוסיף 3 μl של GLB SDS, פיפטה הפתרון בתוך EACh צינור 3 פעמים והכניסו את הצינור על קרח. חזור על שלב זה עבור כל הדגימות והבקרה, בהתאמה, ולשמור על קרח עד שלב הטעינה. הסר את המכסה של מנגנון ג'ל. עומס 13 μl של כל דגימה לתוך הבארות נוצרות וכפי שתואר בעבר על ידי יציקת ג'ל במסרק ויצר היטב. טען את הדגימות הבאות כדי דיווח באיור 1. החזר את המכסה של מנגנון ג'ל. צרף את המוביל של מנגנון ג'ל לאספקת החשמל. בדוק שאלקטרודות מחוברים לחריצים המתאימים באספקת החשמל. הפעל את המחשב ולהפעיל את הג'ל לשעה 2 ו- 30 דקות במתח קבוע של 200 V, עד הצבע יש להעביר עד 1.5 סנטימטרים מעל תחתית הג'ל. לדוגמא הכנה לניתוח פעילות anthraquinone על NC ו( 12-55) NC לדלל את פתרון מניות מתחם 1. הכן 10 μl של 500 מיקרומטר, 250 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, דילול 5 מיקרומטר של מתחם <strong> 1 במי MilliQ. הכן דגימות בקרה כפי שדווח לעיל (סעיף 3.2.). השתמש 2.5 μl של פתרון oligonucleotide 4 מיקרומטר טרי עבור כל דגימה. תמיד להכין כמות עודפת קטנה של כל פתרון למניעת שגיאות pipetting. מקפלים 27.5 μl של 4 מיקרומטר פתרון של TAR ו, בנפרד, של cTAR במאגר TNMg 1x כאמור לעיל (שלב 3.2.1.). לדלל את מניות הפתרון של שני חלבוני NC ופפטיד (12-55) NC 80 מיקרומטר פתרון במים. כאשר פתרונות TAR וcTAR הם מקוררים RT, לבצע צנטריפוגה קצר-ספין של שני הצינורות ולהתחיל את ההכנה של הדגימות. הכן 20 0.5 מיליליטר ריק autoclaved צינורות. מקום 2 שורות של 10 צינורות כל אחד במתלה למעבדת דגימות. תמיד להחליף טיפים בכל עת מגיב שונה משמש. להוסיף כל צינור של השורה הראשונה עם 2.5 μl של TAR המקופל. להוסיף כל צינור של השורה השנייה עם 2.5 μl של cTAR המקופל. <li> הוסף 2 μl של המתחם המתאים דילול 1 (הגברת ריכוז מ -5 מיקרומטר לדילול 500 מיקרומטר) לTAR וcTAR. החלף מתחם עם מים בדגימות לניתוח NC ו( 12-55) NC בהעדר המתחם. דגירה הדגימות במשך 15 דקות ב RT. לאחר 15 דקות דגירה, לערבב את דגימות cTAR (צינורות של שורה השנייה) עם דגימות TAR הכתב (צינורות של השורה הראשונה). הוסף 1 μl של 80 מיקרומטר NC או μl 1 של 80 מיקרומטר (12-55) NC לדגימות לNC או (12-55) ניתוח NC, בהתאמה. לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 3 μl של GLB SDS, פיפטה כל צינור 3 פעמים והכניס את הצינור על קרח. חזור על שלב זה, בהתאמה, באמצעות הדגימות לNC ו( 12-55) ניתוח NC. שמור את הדגימות יציבים על קרח עד שלב הטעינה. הסר את המכסה של מנגנון ג'ל. לטעון 13 μl של כל דגימה לתוך הבארות. טען את הדגימות הבאות כדי שדווח באיור3B יור. החזר את המכסה של מנגנון ג'ל. צרף את המוביל של מנגנון ג'ל לאספקת החשמל. בדוק שאלקטרודות מחוברים לחריצים המתאימים באספקת החשמל. הפעל את המחשב ולהפעיל את הג'ל לשעה 2 ו- 30 דקות במתח קבוע של 200 V, עד הצבע יש להעביר עד 1.5 סנטימטרים מעל תחתית הג'ל. לדוגמא הכנה: מצב אוליגו-preincubation vs מצב NC-preincubation לדלל את המתחם פתרון מניות 1. הכן 10 μl של 500 מיקרומטר, 250 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 5 דילול מיקרומטר של מתחם 1 במי MilliQ. הכן דגימות בקרה כפי שדווח לעיל (סעיף 3.2.). השתמש 2.5 μl של פתרון oligonucleotide 4 מיקרומטר עבור כל דגימה. תמיד להכין כמות עודפת קטנה של כל פתרון למניעת שגיאות pipetting. מקפלים 27.5 μl של 4 מיקרומטר פתרון של TAR ו, בנפרד, של cTAR במאגר TNMg 1x כאמור לעיל (שלב 3.2.1.). לדלל את מניות הפתרון של שני חלבוני NC ופפטיד (12-55) NC 80 מיקרומטר פתרון במים. כאשר פתרונות TAR וcTAR הם מקוררים RT, לבצע צנטריפוגה קצר-ספין של שני הצינורות ולהתחיל את ההכנה של הדגימות. תמיד להחליף טיפים כל ריאגנטים זמן משתנים או אם כל נוזל אחר או פתרון כלול בצינור התגובה הוא נגע. מהצעד הזה על לוודא לתייג באופן ברור ולהפריד את הדגימות לשני הליכים טרום-הדגירה השונות. מצב אוליגו-preincubation הכן 10 0.5 מיליליטר ריק autoclaved צינורות. מקום 2 שורות של 5 צינורות במעמד למעבדת דגימות. להוסיף בצינור אחד של שורת 2.5 μl הראשון של TAR המקופל. להוסיף בצינור אחד של שורת 2.5 μl השני של cTAR המקופל. הוסף 2 μl של המתחם המתאים דילול 1 (הגברת ריכוז מ -5 מיקרומטר לדילול 500 מיקרומטר) לTAR וcTAR.החלף מתחם עם מים בדגימות לניתוח NC בהעדר המתחם. דגירה הדגימות במשך 15 דקות ב RT. לאחר 15 דקות דגירה, לקחת דגימות cTAR (השורה השנייה) ולשים אותם עם דגימות TAR הכתב (השורה הראשונה). הוסף 1 μl של 80 מיקרומטר NC לכל דגימה ודגירת הדגימות במשך 15 דקות ב RT. לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 3 μl של GLB SDS, פיפטה כל צינור 3 פעמים והכניס את הצינור על קרח. שמור את הדגימות יציבים על קרח עד שלב הטעינה. NC-preincubation מצב הכן 5 0.5 מיליליטר ריק צינורות autoclaved ולמקם אותם במעמד למעבדת דגימות. להוסיף בכל μl צינור 4 לדילול מתחם 1 המתאים (הגברת ריכוז ממיקרומטר 5 לדילול 500 מיקרומטר). החלף מתחם עם מים בדגימות לניתוח NC בהעדר המתחם. להוסיף בכל צינור 1 μl של 80 μ; M NC דגירה הדגימות במשך 15 דקות ב RT. מערבבים 15 μl של TAR המקופל עם 15 μl של cTAR המקופל בצינור ולהשתמש בפתרון TAR + cTAR זה בשלב הבא. לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף לכל μl מדגם 5 של פתרון שילוב TAR + cTAR דגירה הדגימות במשך 15 דקות ב RT. לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 3 μl של GLB SDS, פיפטה כל צינור 3 פעמים והכניס את הצינור על קרח. שמור את הדגימות יציבים על קרח עד שלב הטעינה. הערה: מהצעד 3.5.8 ב, ניתוח יכול להתבצע בכל הדגימות (קורות חיים מ3.5.7). הסר את המכסה של מנגנון ג'ל. לטעון 13 μl של כל דגימה לתוך הבארות. טען את הדגימות הבאות כדי דיווח באיור 4. החזר את המכסה של מנגנון ג'ל. צרף את המוביל של מנגנון ג'ל לאספקת החשמל. בדוק שאלקטרודות מחוברים לחריצים המתאימים בsuppl הכחy. הפעל את המחשב ולהפעיל את הג'ל לשעה 2 ו- 30 דקות במתח קבוע של 200 V, עד הצבע יש להעביר עד 1.5 סנטימטרים מעל תחתית הג'ל. 4. הסרת ג'ל וג'ל מכתים לאחר אלקטרופורזה, לכבות את אספקת החשמל, ונתק את החיבורים החשמליים. סגרת את ברז המים של מערכת הקירור ונתק צינורות מהליבה. הסר את המכסה, ו, אם המערכת הייתה מקוררת, להסיר את ליבת הקירור ולשפוך את החיץ משני התאים. בעדינות לפרק את כריך ג'ל מהמנגנון ולהסיר את כל מלחציים מלוחות הזכוכית. כדי להסיר את הג'ל מהצלחות, לדחוף אחד מפרידי לצד הצלחות ולסובב אותה בעדינות כדי למשוך מעלה משם צלחת הזכוכית העליונה. לתפוס שתי פינות של ג'ל ולהרים אותה בעדינות כדי להסיר אותו מהזכוכית. מניחים את הג'ל במכל מתאים עם הפתרון מכתים חומצות גרעין הרצויה לדקות 30-45 עם ערבוב. לאחר צביעה, לשים את הג'ל על מערכת הדמיה transilluminator כדי לזהות אותות הקרינה חומצות גרעין במערכת ג'ל.

Representative Results

איור 1 מציג תוצאת נציג assay Nucleocapsid חישול המתווכת אלקטרופורזה (שם), שבוצע i) עם חלבון רקומביננטי באורך מלא, ii) ללא חלבון, כלומר ערבוב cTAR + TAR ודוגר עד השעה 1 בRT, וiii ) אותו assay הופיע עם (12-55) NC, פפטיד סינטטי חסר 11 חומצות אמינו של תחום N-terminal. (נתיבים מרכזיים TAR-מקופל מראש וcTAR היו מעורבים והיווצרות של TAR heteroduplex המרותק / cTAR הייתה פיקוח בנוכחות NC רקומביננטי באורך מלא (נתיבים שמאליים של איור 1), בהעדר החלבון באיור 1 ), ובנוכחות של (12-55 פפטיד NC) (הנתיבים הנכונים מקוצצים באיור 1). פקדים: מקופלים cTAR, מקופל TAR, ומרותק היברידיים (TAR / cTAR), שהושגו באמצעות denaturation התרמי של המבנים המקופלים ביציבות של TAR לcTAR אחרי annealin האיטי שלהםז. 14 היכולת של NC לפגל שני רצפי חומצות גרעין יציבים לסליל heteroduplex האריך בבירור: חלבון NC באורך מלא מוביל מייד להיווצרות של TAR / היברידי cTAR: 0 'מציין את הזמן המינימלי שעובר בין תוספת של NC ל דוגמאות ותוספת של חיץ טעינת ג'ל, אשר עוצר את התגובה; היווצרות מלאה כבר הושגה לאחר 15 זמן דגירה ". העלייה בעוצמת heteroduplex המרותקת מקבילה לירידה בעוצמת oligonucleotides cTAR וTAR המקופל. היווצרות heteroduplex מושגת גם בנוכחות של הצורה קטועה, כלומר (12-55) NC, המאשרת את הפעילות הביולוגית של פפטיד הסינתטי. בהעדרו של החלבון או של הפפטיד היווצרות heteroduplex לא נצפה, וTAR וoligonucleotides cTAR לא לחשל בטמפרטורת חדר לheteroduplex (איור 1). בכל הניסויים, ההיווצרות מהירה של חומרי ביניים לא יציבים ("מתחמי ביניים" באיור 1) שירידה לאורך הזמן הוא ציין, באופן עקבי עם המנגנון המוצע של חילופי גדיל באמצעות סיכות הראש של cTAR וTAR עד חומצות גרעין הנכונות מתקפלות. 17 פתרון בעיות אפשריות של הניסוי הוא חוסר SDS במאגר טעינת ג'ל. בהעדר SDS בGLB התוצאה של התגובה מוצגת באיור 2 והשוואה לתוצאה עם GLB + SDS. TAR-מקופל מראש וcTAR היו מעורבים וטופחו במשך 3 שעות בRT של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם חלבון NC באורך מלא רקומביננטי. לאחר הדגירה הדגימות פוצלו לשתיים: למאגר טעינת המחצית ג'ל אחד ללא SDS (GLB) נוספו, ואילו למחצית אחרת GLB היה עם SDS (GLB SDS). דוגמאות הועמסו על הג'ל, ואת המיקום של להקות חומצות גרעין היה דמיין אחרי ג'ל המנוהל על ידיכתמי צבע. כאשר NC היה נוכח אבל הדגימות עמוסות GLB, כל להקות חומצות הגרעין הוזזו עד: זה צפוי ומציינת חזק מחייב בין החלבון וחומצות גרעין. התוצאות עם GLB SDS מוצגות בימין הקיצוני של ג'ל: התוספת של SDS denatures החלבון ומשחררת חומצות גרעין מהמתחם היציב עם החלבון, המאפשר השוואה עם קבוצת הביקורת. Assay השם משמש כדי להעריך את היכולת של השחלה intercalators לייצב מבני חומצות גרעין דינמיים ומעכבים את פעילות NC מלווה. 14 intercalators Threading הם מולקולות ריחניות מישוריים הוחלפו על ידי שרשרות צד מגושמות הממוקמים באתרים נגדיים של מערכת הטבעת, כגון anthraquinone ניתן לראות באיור 3 א. 18 intercalators אלה מסוגלים להשחיל דרך הסליל הכפול של חומצות גרעין, לבסוף איתור הרשתות בצד שלהם בכל חריץ של כפולסליל. 19,20 איור 3 מציג את התוצאה של assay שם בנוכחות המתחם 1, intercalator השחלה ידועה, 18 בנוכחות באורך מלא NC או של הפפטיד הקטוע. בשני המקרים, היווצרות ההיברידית TAR / cTAR על ידי NC היא מופחתת על ידי הגדלת הריכוז של intercalator, ואילו, באותו הזמן, בסך של TAR החופשי ועליית cTAR. הצורה קטועה של החלבון חסר זנב N-terminal (12-55NC) היא יותר רגישה לעיכוב פעילותו: הבדל זה אומת עם כל התרכובות שנבדקו עד כה. Assay השם יכול להתבצע בשתי דרכים, או על ידי מראש דוגרים מתחם הבדיקה עם NC, ואחריו תוספת של oligonucleotides המקופל (מצב NC-preincubation), או על ידי preincubating מתחם המבחן במשך 15 דקות עם מצעי חומצות גרעין המקופלים , ואחריו תוספת של NC ודגירה נוספת במשך 15 דקות (אוליגו-PRמצב eincubation). למרות זמן הדגירה הכללי הוא זהה בשני מצבים שונים, preincubation עם oligonucleotides המקופל לפני תוספת של NC מאפשר יותר זמן לשחלה של intercalators לחומצות גרעין המקופל. התוצאה היא ייצוב חזק של המבנים הדינמיים שלהם ולעיכוב קל של פעילויות מלווה NC. הניתוח של assay שם בשני המצבים ולכן משפר את ההבדלים במנגנון פעולה של מעכבי NC, כפי שמוצג באיור 4: כאשר מתחם 1 נותח בשמו במצב אוליגו-preincubation (איור 4, נתיבים משמאל) זה מראה עיכוב חזק של חישול בתיווך NC, ואילו עיכוב הרבה יותר נמוך נצפה במצב NC-preincubation (איור 4, נתיבים מימין). אנא שים לב כי לקביעת ריכוזים מעכבים בזמן הקרנת סטים של תרכובות הקשורות עם assay זה ובתנאים אלה, כל התנסותment חייב להתבצע לפחות בשלושה עותקי שימוש בריכוזים צפופים (במיוחד סביב ערך IC 50). 14 איור 1:. Assay שם עם באורך מלא NC ועם (12-55) NC TAR המקוצץ המקופל וcTAR, כל 1 מיקרומטר, הודגרו עם NC רקומביננטי או עם (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) ל0 דקות, 15 דקות, 30 דקות ושעה 1. TAR וcTAR מודגרות בהיעדר החלבון (0 דקות, 15 דקות, 30 דקות ושעה 1) שמשו כביקורת שלילית. TAR המקופל, cTAR המקופל וTAR ההיברידי / cTAR מתקבלים לאחר denaturation התרמית ואחריו במבחנה חישול שמשו כקבוצת ביקורת. התגובות אז היו הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג'ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג'ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. איור 2:. אפקט של SDS במאגר טעינת ג'ל (GLB) בעת ניתוח TAR / cTAR חישול על ידי NC TAR וcTAR, prefolded בTNMg 1x, הודגרו עם אורך מלא רקומביננטי NC (oligos / NC = 1/8) במשך 3 שעה בטמפרטורת חדר או על 37 מעלות צלזיוס. GLB או GLB SDS נוספו לאחר מכן לדגימות מודגרות עם NC. בקרות: TAR, cTAR וTAR ההיברידי המרותק / cTAR (כל 1 מיקרומטר). אלקטרופורזה בוצעה באמצעות 12% ג'ל polyacrylamide בTBE 1x; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג'ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. נתון זה שונה מאיור S4 של:. Sosic, א 'ואח' עיצוב, סינתזה והערכה ביולוגית של TAR וקלסרים cTAR כHIV-1 מעכבי nucleocapsid 4 MedChemComm, 1,388-1,393, doi:. 10.1039 / c3md00212h (2013) . "> איור 3: (א) מבנה כימי של intercalator השחלה 1. (B) השפעה של השחלה intercalator 1 הוערך על ידי assay NAME. מקופל TAR וcTAR, כל 1 מיקרומטר, הודגרו בנוכחות הריכוזים מצויינים של המתחם 1 עם האורך מלא NC או עם (12-55) NC, כל 8 מיקרומטר. TAR המקופל, מקופל cTAR וTAR heteroduplex המורחב / cTAR שימש כקבוצת ביקורת. התגובות אז היו הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג'ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג'ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. איור 4: אוליגו-preincubation לעומת מצבי NC-preincubation: השפעות על assay NAME mod אוליגו-preincubation.דואר: TAR מקופל ומקופל cTAR, כל 1 מיקרומטר, היו preincubated עם הריכוזים מצויינים של intercalator השחלה 1 במשך 15 דקות, ולאחר מכן במשך 15 דקות נוספות בנוכחות באורך המלא NC (8 מיקרומטר) NC-preincubation. מצב: ריכוזים המצוינות של intercalator השחלה 1 היה preincubated עם האורך המלא NC (8 מיקרומטר) במשך 15 דקות, ולאחר מכן במשך 15 דקות נוספות בנוכחותו של TAR המקופל ומקופל cTAR, כל 1 מיקרומטר. TAR המקופל, מקופל cTAR וTAR heteroduplex המורחב / cTAR שימש כקבוצת ביקורת. כל התגובות לבסוף הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג'ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג'ל הוכתמו וזוהה על transilluminator.

Discussion

NAME הוא assay המאפשר להעריך את העיכוב של פעילות המלווה של חלבון nucleocapsid של HIV-1, יעד מעניין בחיפוש של תרופות נגד HIV רומן במהירות. NC anneals מהיר ובחומצות גרעין טמפרטורת חדר שיציבה מתקפל אחרת דורש denaturation התרמי בטמפרטורה גבוהה ואחרי חישול זהיר. Assay יכול להתבצע עם או באורך מלא NC או עם המקוצץ (12-55) NC: בשני המקרים שתי חומצות גרעין (RNA ועותק DNA משלים) הן מרותקים במהירות. זה עולה בקנה אחד עם תצפית ספרות עם פפטיד NC הקטוע: חישול הוא ביוזמת ההיתוך היעילה של הגזע של cTAR אחרי אינטראקציה של הלולאה שלה משלימה הפסגה, שהוא אתר NC חלש מחייב, עם הרצף המשלים של לולאת פסגת TAR, ובסופו דרך כמה ביניים יציבים להוארך היברידי המרותק. 21

NC הוא prot יציב מאודעין וכמה בעיות בעת ביצוע NAME יכולים להתרחש. זה מאוד חשוב עם זאת להוסיף SDS טרי בטעינת ג'ל המאגר משמש כדי לעצור את התגובה: אם זה לא יושג, ג'ל לא יציג את להקות חומצות גרעין בעמדות הנכונות. למעשה, NC הוא חלבון חומצת גרעין מחייב, כך שכדי לחזות בצורה נכונה TAR / heteroduplex cTAR על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS חייב להיות נוכח בטעינת ג'ל המאגר לפגל החלבון ולשחרר אותו מהמתחם ההדוק שלה עם חומצות הגרעין. זהו גם פתרון בעיות אפשריות של הניסוי, כלומר ההיווצרות של להקות השתנו בזמן ריצת ג'ל. השפעה זו בולטת במיוחד כאשר באורך המלא NC הועסק, כמו באיור 2, והוא צמוד לנוכחות של הזנב N-terminal הבסיסי ביותר, שיש לו השפעה חזקה על צבירת חומצות גרעין.

הנוכחות של הזנב הבסיסי המסוף הופכת את תגובת חישול יותר קשה להיות מעוכבת, כתכניתn באיור 3 מתחם באמצעות 1, intercalator השחלה נציג, כלומר intercalator יעיל במיוחד בייצוב מבני גזע הלולאה של TAR ושל cTAR. למעשה, זה סוג של אינטראקציה עם חומצות גרעין הוא מועדף כאשר בליטות ולולאות לקטוע את רצף הסליל הכפול, המאפשרים להשחלה קלה יותר של מתמירים מגושמים לזוגות הבסיסים. ייצוב של TAR וcTAR ידי קלסרים חומצות גרעין אלה נותח בעבר על ידי קביעת העלייה בטמפרטורת ההתכה של שני oligonucleotides. 14 יתר על כן, העלייה בטמפרטורת התכה בקורלציה עם העיכוב של חישול זרז על ידי HIV-1 NC, הבא להקמתה המופחתת של TAR / cTAR heteroduplex ומצביע על כך שintercalators השחלה היא כיתה מעניינת של קלסרים עבור מבנים דינמיים של RNA כגון אלמנט TAR. 14

מנגנון פעולה מופעל על compo אלהunds ניתן תוקף נוסף על ידי ביצוע assay NAME בפורמטים חלופיים שונים, כפי שמוצג באיור 4: במקרה של intercalators העיכוב של heteroduplex המרותק מוגבר כאשר התרופה הודגרו עם שני oligos המקופל. תרכובות הפועלות במנגנון פעולה שונה, כגון קלסרים ישירים של חלבון NC, תהיה מושפעות פחות מהמצב preincubation שונה. assay שם מבוצע בשתי השיטות ולכן יכול לשמש מסך ספריות של תרכובות לזיהוי מעכבי NC, וגם להעריך את המנגנון המשוער של פעולה של הלהיטים החיוביים תוך חיפוש התרופות נגד HIV הממוקדים בNC. ברור, השימוש בטכניקות אלה לבד כאשר הטענה למנגנון ספציפי של פעולה של מעכבי NC מזוהים אינו מספיק, ויש צורך במבחנים ביוכימיים מתאימים אחרים כדי לקיים את נחת העבודה. 14

לבסוף, יש להדגיש כי שם משתמש ביותראנזימים מטוהרים, או רקומביננטי או סינטטיים, מתן מידע יקר על עיכוב "במבחנה" של NC על ידי התרכובות נבדקו. זהו "הכוח והחולשה" של assay: שם יכול גם להשלים הקרנה וירטואלית והדמיה מולקולרית מתקרבת בצעדים הראשוניים של תוכניות גילוי תרופות, המאפשרת לבנות במהירות ולנתח מערכות יחסים מבנה-פעילות וסופו של דבר הפניית עיצוב הסינתזה וסמים. עם זאת, כפי שמבחני ביוכימיים אחרים המשמשים בפרויקטים לפיתוח תרופות בHIV, NAME לא נותן מידע על ההשפעות של מעכבים משוערים בתאים נגועים בנגיף.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Materials

Name of Material/Equipment Company Catalog Number Comments/Description
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 mL tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µL Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µL Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0,22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1M solution at       -20°C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks 
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
  2. Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
  3. Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
  4. Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
  5. Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
  6. Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
  7. Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
  8. Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
  9. Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
  10. Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
  11. Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
  12. Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
  13. Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , .
  14. Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
  15. Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
  16. Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Bioquímica. 42, 10736-10745 (2003).
  17. Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
  18. Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
  19. Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
  20. Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
  21. Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).

Tags

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) AssayHIV-1 Nucleocapsid Protein (NC)RNA/DNA FoldingAntiviral Drug DevelopmentNC Chaperone Activity InhibitionThreading IntercalatorPAGE Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image