Generación de murino cardíaca marcapasos celulares Agregados Basado en ES-Cell-Programación en combinación con MYH6-promotor-Selección
Summary
Este protocolo describe cómo producir seno tejido ganglionar funcional a partir de células madre pluripotentes murinos (PSC). T-Caja3 (TBX3) sobreexpresión plus-cadena-miosina pesada cardiaca (MYH6) selección antibiótico promotor conduce a agregados de células marcapasos de alta pureza. Estos "inducida sinoauricular-cuerpos" ("iSABs") contienen más de 80 células marcapasos%, muestran altamente aumento de las tasas de latir y se puede regular el ritmo miocardio ex vivo.
Abstract
El tratamiento del "síndrome del seno enfermo" se basa en los marcapasos artificiales. Estos llevan peligros tales como fallo de la batería y las infecciones. Por otra parte, carecen de la capacidad de respuesta de la hormona y el procedimiento general es costosa. "Marcapasos biológicos" generados a partir de las ventanillas únicas pueden llegar a ser una alternativa, sin embargo, el contenido típico de las células marcapasos en cuerpos embrionarios (EB) es extremadamente baja. El protocolo descrito combina "programación futura" del PSC murinos través del TBX3 inductor nodo sinusal con antibióticos de selección basado MYH6-promotor. Esto produce agregados cardiomiocitos consistentes de> 80% de células marcapasos fisiológicamente funcionales. Estos "inducida por sinoauricular-cuerpos" ("iSABs") se contraen espontáneamente a frecuencias aún no alcanzados (400-500 bpm) correspondientes a las células ganglionares aisladas de corazones de ratones y son capaces de caminar de miocardio murino ex vivo. Utilizando el protocolo descrito sinusal altamente puracélulas individuales nodales se pueden generar por ejemplo, que se puede utilizar para pruebas de drogas en vitro. Por otra parte, los iSABs generados de acuerdo con este protocolo puede llegar a ser un paso crucial hacia la ingeniería de tejidos del corazón.
Introduction
El término "síndrome del seno enfermo" resume múltiples enfermedades que conducen al deterioro del sistema de marcapasos cardíaco. Comprende patológica, bradicardia sintomática sinusal, bloqueo sinoauricular, paro sinusal, así como el síndrome de taquicardia-bradicardia. De este modo, un "síndrome del seno enfermo" suele ir acompañada de enfermedades cardíacas generales tales como la cardiopatía isquémica, las miocardiopatías o miocarditis. En la actualidad, los enfoques terapéuticos se basan en la implantación de marcapasos eléctricos. Sin embargo, esto va junto con una serie de riesgos tales como infecciones y fallo de la batería. En general, la incidencia de complicaciones es todavía muy alta en pacientes que han implantaron un marcapasos artificial. Además, a diferencia de la marcapasos endógeno, estos dispositivos no responden a la estimulación hormonal.
Una alternativa de futuro puede depender de la disponibilidad de "marcapasos biológicos" para el que PSC podrían servircomo fuente celular adecuado y que también sería de gran valor para vitro pruebas de drogas en. Sin embargo, un problema importante reside en la aparición muy rara de células nodales de los senos dentro de cuerpos embrioides (EBS) – esto normalmente no excede de ~ 0,5% 1.
Anteriormente, se demostró que la "programación hacia adelante" hacia los subtipos específicos de los cardiomiocitos es factible a través de la sobreexpresión de factores de transcripción distintos cardiovasculares precoces tales como el factor-mesodermo específica posterior 1 (MesP1) y NK2 de transcripción relacionados, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Para el tamaño y la función del nódulo sinoauricular (SAN) normal, la T-box factor de transcripción Tbx3 es crucial, que se ha demostrado para iniciar el programa de genes marcapasos y para controlar la diferenciación de la SAN 4. Si bien esto mejora la apariencia de las células marcapasos funcionales, el contenido todavía no excedió de ~ 40% dentro de toda la población de células cardiomyocytic.
Por lo tanto, una etapa de selección de antibiótico basado MYH6-promotor adicional 5 fue introducido por nosotros. Esto conduce en última instancia a los agregados de cardiomiocitos todavía no observados ("cuerpos inducidos sinoauricular;" iSABs ") que exhiben altamente aumento de la frecuencia golpeando (> 400 bpm) in vitro, por primera vez se aproxima a las de un corazón murino y comparable a cultivado in vitro las células ganglionares de los senos aisladas de un corazón murino 6. Bajo la administración Isoprenalina se logran incluso superando frecuencias de 550 lpm. Notablemente, iSABs consisten en más del 80% de las células ganglionares funcionales como se desprende de un extenso análisis fisiológico 7. Recientemente, varios enfoques para generar seno células ganglionares mediante la reprogramación directa 19, superficie marcadores 14 o el tratamiento farmacológico con pequeñas moléculas 16,17 fueron descritos. Sin embargo, ninguno de estos métodos dio lugar a una alta pureza de las células marcapasos tal y golpeando a frecuencias cercanas a la murino élarte como se observa en iSABs.
Por otra parte, en un modelo ex vivo de las rebanadas ventriculares ratón adulto cultivadas que han perdido su actividad paliza espontánea, los iSABs son capaces de integrarse en el tejido rebanada, por lo que permanece activa espontáneamente y robustamente paseo por las rebanadas del corazón a las contracciones 7. Un protocolo detallado para la generación de estos iSABs se describe en este documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de producir tallo de células derivadas de células marcapasos cardíacos puede permitir la reconstitución del ritmo cardíaco adecuado en el sentido de "marcapasos biológicos". Del mismo modo, las pruebas de drogas in vitro se beneficiará de su disponibilidad. PSC puede dar lugar a cualquier tipo de célula del cuerpo de un mamífero incluyendo cardiomiocitos con propiedades de células marcapasos 8,9,10,11,12,13. Sin embargo, por lo general las poblaciones de células dentro de &qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
Referências
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
