Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.
A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.
Enteriske vira er en forskelligartet gruppe af virus, der inficerer det menneskelige tarmsystem og som overføres via det fækale-oral vej. Disse vira indtaste overfladevand og grundvand gennem rensningsanlæg og septiktanke spildevand, forkert konstrueret eller brudt septiktanke, brudte kloakledninger, overløb og andre point og diffuse kilder 1-4. Menneskelige infektioner og sygdomme fra vandbårne virus ske via forbrug af forurenet eller utilstrækkeligt desinficeret vand eller gennem rekreative vand kontakt. symptomer kan indebære mild til svær gastroenteritis sygdom; conjunctivitis; feber; øvre respiratorisk distress; hånd, mund- og klovsyge; myocarditis; aseptisk meningitis; encephalitis; lammelse; sepsis 5-8, og død 9,10.
USEPA Method 1615 giver en procedure til at måle infektiøse enteriske viruspartikler i miljø- og drikke vand. Disse farvande kan indeholde enblanding af infektiøse og ikke-infektiøse virioner, men kun de infektiøse partikler udgør en potentiel sundhedsrisiko. Infektiøse viruspartikler mister infektivitet over tid i miljø- og drikke vand fra tab af protein capsid integritet, beskadigelse nukleinsyrer grundet UV-stråling fra sollys, og skader på grund af eventuelle desinfektionsmidler, der kan være til stede 11-13. Den samlede virus procedure dyrkbar tilvejebragt i fremgangsmåden er baseret på produktion af cytopatiske virkninger (CPE) i Buffalo Green Monkey nyre (BGM) cellelinie. Denne cellelinie blev valgt på grund af den udbredte anvendelse i den miljømæssige virologi felt 14,15, selv om udvalget af infektiøse virustyper detekterede er begrænset primært til visse enterovirus 15. Formålet med dette dokument er at beskrive metode 1615 procedurer til eluering af fem-tommer elektropositiv patronfiltre, sekundær koncentration, og måling af de samlede dyrkbare vira. En evaluering afsamlede fremgangsmåde er beskrevet i Cashdollar et al. 16.
USEPA Method 1615 blev udviklet til brug under ureguleret Kontaminant Overvågning forordning tredje overvågningsperiode (UCMR3) 17 og designet primært til at måle virus forekomst i grundvandet. Den deler en række fælles skridt med Information Collection Rule (ICR) metode, 15,18, men har to mindre forskelle. Begge bruger kvantale analyser til at måle virus, der producerer CPE på BGM cellemonolag med kvantificering er baseret på mest sandsynlige nummer (MPN) beregninger. Fremgangsmåde 1615 tillader anvendelse af en nyere elektropositiv filter til koncentrering virus fra forskellige vand matricer og reducerer antallet af cellekultur testbeholder replikater pr fortynding fra 20 til 10. Begge mindre ændringer reducere de samlede omkostninger metode. Reduktionen i antallet af replikater reducerer arbejdskraft, men resulterer i en lidt lavere detektionsgrænse. Selvom forventes grundvand at have lavere koncentrationer af virus end overfladevand, 19,20 the mængde prøve analyseret er fem gange større end overfladevand, kompenserer delvist for forskellene. Brugen af færre gentagelser vil være tilstrækkelig for de fleste overfladevand, men nogle vil kræve prøve fortynding.
Metode 1615 har flere kritiske trin og begrænsninger. Oksekød ekstrakter varierer fra parti til parti. Hvert parti skal testes for effektiviteten af virus eluering og kapaciteten for virus koncentration gennem de sekundære koncentrering som beskrevet er supplerende materiale sektion S2.3. Den metode bruger præcise formler for beregning af prøven for at pode på BGM cellekulturer og til at bestemme virustitere. Unøjagtige resultater vil blive genereret, hvis disse formler ikke strengt følges. Korrekt aseptisk teknik skal anvendes til opretholdelse af cellekulturer. Inficerede BGM cellekultur, der viser nød i løbet af 14-dages inkubationstid sandsynligvis indikerer problemer med vedligeholdelse cellekultur. Stor omhu skal også være taken under pipettering trin involveret med podning af og mellemstore tilføjelse til celle kultur flasker for at undgå krydskontaminering. De kvalitetskontrol, der er beskrevet i supplerende materialer Afsnit S2 skal være strengt følges. Afsnit S2 giver også råd om fejlfinding for kvalitetsproblemer.
Den primære mekanisme for virusadsorption til elektropositiv filtre er en afgift interaktion relateret til styrken af den positive ladning på filteret og styrken af virus 'negative ladning relateret til dets isoelektriske punkt, og pH af vandet, der testes 21. Eluering fra filtre også påvirkes af styrken af disse interaktioner. Fordi de varierer blandt virustyper og selv blandt stammer af samme type, eluering fra filtrene ikke er ensartet. Det betyder, at ethvert resultat kan undervurdere det faktiske niveau af virus til stede i vandmiljøet. Brugen af den fælles BGM cellelinje undervurderer også virus forekomst. Serienaf enterisk virus, der kan producere CPE i denne cellelinie primært er begrænset til poliovirus og Enterovirus B Art serotyper samt nogle reovira 14,15,22. vil ikke blive opdaget andre infektiøse virustyper.
Poliovirus inddrivelser fra jorden og reagens kvalitet farvande mødte USEPA Method 1615 kriterier ydeevne acceptkriterier for både Performance Evaluation (PE, dvs. seedet reagenskvalitet vandprøver med titre ukendte til en analytiker, der bruges til at evaluere resultaterne af analytikeren før starten af en undersøgelse) og LFB prøver (supplerende materiale tabel S1). Den 58% genvinding fra grundvand under anvendelse af proceduren kultur er den samme som rapporteret af andre, der bruger ledningsvand 23,24. Den gennemsnitlige genvinding fra LFB prøver af 111% med en variationskoefficient (CV) på 100% mødte også kriterierne metode ydeevne accept, selvom de er højere end observeret til PE prøver during af ICR. ICR betyde sammenlignende opsving var 56% med en variationskoefficient (CV) på 92%, mens gennemsnitlige intralaboratorie inddrivelser varierede fra 36 til 85% (CV 58-131%, upublicerede data fra ICR PE-databasen). Højere genfindelse blev observeret i denne undersøgelse for lav frø LFB prøver end for højere frøprøver (122 versus 42%). På det tidspunkt, at ICR blev planlagt, var det forventet, at PE-prøver, der modtager lave frø værdier ville have lavere opsving, der får høje frø. Svarende til den observeret her for LFB prøverne, poliovirus recovery for ICR PE prøver var 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), og 44% (CV 71%) for frø værdier ≤300 MPN, 300- 1.500 MPN, og> 1.500 MPN hhv.
Der er mange metoder til måling infektiøs virus i vandprøver 25. Denne metode er betydelig i forhold til andre metoder i grad af standardisering. Standardiseringen omfatter ikke kun kvalitet og ydeevne kontrol,men også bruger definerede mængder og formler til at sikre, at alle analyselaboratorier udføre metoden identisk. Uden standardisering, er det vanskeligt at sammenligne resultater på tværs af laboratorier, og derfor standardisering er afgørende, når der udføres omfattende undersøgelser i flere analyselaboratorier store. Med den indbyggede standardisering denne metode kunne udvides i fremtiden til at omfatte yderligere virustyper og cellelinier. Forskning er i gang for at levere data for optagelse af adenovirus i metoden.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |