Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte

Ethics Statement: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt wurden, und wurden im Einvernehmen mit Großbritannien Home Office Richtlinien (genehmigt http://goo.gl/FLkirW , letzter Zugriff 10 Juni , 2014) und der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , letzter Zugriff 10. Juni 2014). 1. Ocular Hypertension Induktions Induzieren experimentellen Glaukom durch Erhöhung des Augeninnendrucks (IOP) durch einseitige Injektion von paramagnetischen Mikrosphären in der vorderen Kammer des Brown-Norway-Ratten, basierend auf der Methode von Samsel et al. 3 Andere pigmentierte Ratten geeignet sein können, obwohl diese müssten validiert zuerst durch den Benutzer. Haus von 250 bis 300 g weiblichEx-Züchter Brown Norway Ratten in einem ständigen schlechten Lichtverhältnissen (40-60 lux) auf Tagesschwankungen IOP 7 zu minimieren, mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum. Sie intra IOP-Messungen an wachen Tieren 8 vor der Anästhesie und Wulst Injektion, unter Verwendung eines Rebound-Tonometer zur Verwendung im Rattenauge 9 kalibriert. IOP wird als Mittelwert von fünf Ablesungen vorgenommen. Betäuben Ratten mit 37,5 mg / kg Ketamin und 0,25 mg / kg intraperitoneal Medetomidinhydrochlorid geliefert. Narkosetiefe Bestätigen Sie durch Testen hinteren Fuß Reflexe Tieres, vor der Jod-Anwendung (siehe Schritt 1.5), und Perlen Injektion Povidon (siehe Schritt 1.8). Verwalten 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie. HINWEIS: die Schüler jederzeit erweitern Sie nicht. Dies wird helfen, die Perlen, sich besser in die Kammerwinkel zu regeln, und verhindern, dass die Bindung an der Linse. Bewerben Augensalbe zur Hornhaut Trocknen auf un-betriebenen andere Auge zu verhindern. WAsche der operativen Augen mit 5% Povidon-Iod in Wasser 10 5 min vor der Injektion. Nach 5 min Docht die Povidoniod Ausschalten mit steriler Gaze, und waschen Sie das Auge mit 0,9% steriler Kochsalzlösung. Halten Sie die Augen während der Narkose bei regelmäßiger Anwendung steriler Kochsalzlösung feucht. Legen Sie einen Ringmagneten um das Auge. Injizieren 25 ul einer Lösung, die 30 mg / ml des gamma-Bestrahlung sterilisiert 8 um magnetischen Mikrokügelchen in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in die vordere Augenkammer, mit einer 33 G Nadel abgeschrägt. Um Perlen herzustellen, Waschen durch Resuspendieren und dann 3mal Zentrifugieren bei 10.000 xg für 5 Minuten mit 1 ml HBSS, bevor die endgültige 30 mg / ml Lösung. Pflegen sterilen Bedingungen im gesamten. Für die Injektion vorsichtig sein, um zu vermeiden, die Nadel an der Iris, um das Risiko von Iris Trauma zu minimieren. Dies kann durch Ausrichten der Nadel tangential zur Hornhautoberfläche verhindert werden, die parallel zudie Iris wie möglich. Dies wird auch dazu beitragen, Perlenverlust von der Injektionsstelle zu minimieren. Hinweis: Spritzen Sie Perlen mit einer schnellen Rate, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Kammerwinkel, die entscheidend für die Anhebung IOP ist zu gewährleisten. Zusätzlich Shop Perlen, Nadeln und Magnetringe getrennt, so dass die Perlen bilden keine Cluster, so dass sie nur schwer in die Spritze zu laden und zu injizieren, und die Nadel nicht magnetisiert werden. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für 1 min nach der Injektion um sicherzustellen, dass es sich in Perlen der Kammerwinkel zu wässrigen Kondensat ab, das Trabekelwerk behindern. Leicht Winkel der Nadel nach der Perlen wurden zunächst einige Leckage von wässrigen zu ermöglichen, um eine vorübergehende Erhöhung des Augeninnendruck zu minimieren siedelt. Am Ende der Operation zu spülen Sie die Nadel durch mit ersten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), dann 70% Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser, um die weitere Verwendung der Nadel in getrennten Verfahren zu gewährleisten. Alternativ könnte man verwendenEinweg-Nadeln, wenn die richtige Spurweite und Spritze Kombination zur Verfügung. Optional: Nadeln mit Hilfe eines Schweißkantenformer, deren Nutzung zu verlängern geschärft werden. Zu diesem Zeitpunkt ggf. entfernen Sie den Magneten, und verwenden Sie es, um die Kügelchen in Bereiche unvollständige Abdeckung ziehen. Lassen Sie den Magneten an Ort und Stelle um das Auge für weitere 10 min nach der Injektion, um sicherzustellen, Perlen absetzen gut in die Kammerwinkel. Reverse Anästhesie unter Verwendung von 0,25 mg / kg atipemezole Hydrochlorid. Verabreichen Chloramphenicol oder anderen Antibiotika-Salbe, beispielsweise Gentamycin oder Terramycin topisch auf eine Infektion zu verhindern, und 0,5% Proparacain-Hydrochlorid zur Analgesie. Lassen Sie Tiere auf eine Wärmematte erholen, bis sie die Bewegung wieder zu erlangen, dann in einen warmen Box und Versorgung mit zusätzlicher Nahrung, zu übertragen, wie als Nahrungsergänzungsmittel oder angefeuchtet normalen Ernährung, bis die Wiederherstellung abgeschlossen ist. Systemische oder lokale Analgesie sollte Tiere mit Anzeichen von Schmerzen 24 Stunden nach der Operation gegeben werden. Wenn thestrotz Behandlung e anhaltenden Beschwerden sollten die Tiere auf humane Weise getötet werden. Verwenden Sie das andere Auge als nicht operierten Kontrolle. Nehmen IOP-Messungen alle 2-3 Tage nach der Wulst Verabreichung und alle 2-3 Tage danach mit einem Rebound-Tonometer zur Verwendung im Rattenauge 9 kalibriert. Die Kriterien für die Aufnahme in die Augen Studien können sein: wenn 1) die IOP über der kontralateralen Kontrolldruck von 5 mm Hg erhöht, und 2) nicht über 60 mm Hg nicht übersteigt. Augen, wo der Druck wieder zum Ausgangswert (in der Regel von 1 Woche nach der Injektion) sollte nicht in die Studien aufgenommen werden, ist es jedoch möglich, wieder zu injizieren Perlen in die Augen, die zu hohen Augeninnendruck entwickeln, wenn gewünscht ausfallen. Euthanize Tiere durch CO 2 Erstickung am Ende des Experiments. Präparieren Sie die Augen und Sehnerven, und befestigen Sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht für weitere histologische Analyse. 2. Beurteilung der Netzhaut Neuron Schaden Mit TUNEL Shaltigen Um apoptotischen Zellen zu quantifizieren in ganze Berg retinasuse der Desoxyribonukleotidyltransferase vermittelte dUTP nick-Kennzeichnung (TUNEL) Assay, nach den Anweisungen des Herstellers. Präparieren der Netzhaut von der Augenmuschel, Waschen für 3 x 5 min in 0,3% Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (T-PBS). Permeabilisieren Gewebe in 3% T-PBS für 2 Stunden. Pre-äquilibrieren Retinae in Äquilibrierungspuffer 10 min, vor der Inkubation TUNEL Reaktionslösung 1 h bei 37 ° C. 3 x 5 min in 0,3% T-PBS waschen das Gewebe gründlich in 0,3% T-PBS mit 5 uM DAPI und Flachhalterung bei der Montage Medien. Zur Quantifizierung TUNEL positiven Kerne mit einem konfokalen Mikroskop bis 10 um z-Stacks durch die Ganglienzellschicht bei 20-facher Vergrößerung zu nehmen. Nehmen Sie 3 Bilder auf jedem der 4 Blütenblätter, an Orten in der Nähe des Sehnervs, in der Mitte der Peripherie, und am äußersten Peripherie der Netzhaut, was eine Gesamtzahl von 12 Bildern pro ganze mount, Probenahme ca. 7.000 Zellen. Morphologischer Kriterien unterschieden nicht neuronale (endotheliale und Glia-Zellen) aus neuronalen Zellen. Wählen Sie die Bereiche für die Bildgebung nur mit der DAPI-Kanal und Maske Ermittler zu den Behandlungsgruppen. 3. Bewertung Optic Nerve Damage Mit Toluidinblaufärbung Fix Sehnerven Nacht in Karnovsky-Lösung bei 4 ° C. Saures Proben für 2 Stunden in 1% (w / v) Osmiumtetroxid und anschließend in 100% Ethanol dehydriert. Sehnerven in Propylenoxid inkubieren für 30 Minuten, und legen Sie in einer 50:50 Mischung von Propylenoxid: Araldit Nacht. Wechseln diese Lösung zu 100% Araldit, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 60 ° C. Cut Semidünnschnitten (0,75 mm dick) und Fleck mit 1% Toluidinblau / Borax (TB) in 50% Ethanol vor der Sachprüfung mittels Lichtmikroskopie. 4. Statistische Analyse Die statistische analysiert mit einem entsprechenden Statistik-Software-Paket. Ein Zwei-Wege-ANOVA mit der Newman-Keul Post-hoc-Test kann verwendet werden, um die statistische Signifikanz berechnen IOP über die Zeit verändert werden. Ein p-Wert von weniger als 0,05 kann als signifikant angesehen werden.