Summary

Metodologia sintética para Asymmetric Ferroceno Derivados Sistemas Bio-conjugadas via Metodologia base de resina em Fase Sólida

Published: March 12, 2015
doi:

Summary

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Abstract

A detecção precoce é uma chave para o sucesso do tratamento da maioria das doenças, e é especialmente indispensável para o diagnóstico e tratamento de vários tipos de cancro. As técnicas mais comuns utilizados são métodos de imagem, como a ressonância magnética (MRI), Positron Emission Topografia (PET), e Topografia Computadorizada (CT) e são ideais para a compreensão da estrutura física da doença, mas só pode ser realizada uma vez a cada quatro a seis semanas, devido à utilização de agentes de imagiologia e de custo global. Com isto em mente, o desenvolvimento de "point of care" técnicas, como biossensores, que avaliam o estágio da doença e / ou a eficácia do tratamento no consultório do médico e fazê-lo em tempo hábil, iria revolucionar os protocolos de tratamento. 1 Como um meio para explorar biossensores ferroceno base para a detecção de moléculas biologicamente relevantes 2, foram desenvolvidos métodos para produzir conjugados de bio-ferroceno-biotina aqui descritos. Este relatório vai se concentrar em um sistema-biotina-ferrocene cisteína que pode ser imobilizada em uma superfície de ouro.

Introduction

Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam a tecnologia de reconhecimento biomolecular como a plataforma para análise seletiva e são utilizados para a sua especificidade, velocidade e baixo custo. Os biossensores eletroquímicos para a detecção de biomoléculas estão na vanguarda deste campo, devido à sua simplicidade, custo-benefício, e alta sensibilidade. 1,3 A anatomia geral destes sensores é um eletrodo equipado com uma molécula de reconhecimento específico para o marcador biológico de interesse . A ligação do marcador por molécula de reconhecimento resulta de uma alteração local do potencial ou da corrente que pode ser detectada por uma simples medição. Até à data, a porção reconhecimento pode variar de enzimas, anticorpos, 4-8 9-12 células inteiras, 13-16, 17-20 receptores peptídeos 21-23 e 24 e de DNA em grande parte com foco em moléculas maiores, biológicos. 25-28 Research esforços nessa arena têm se concentrado principalmente na imunossensores where uma imunoglobulina é imobilizada com um núcleo activo redox (tais como ferroceno) e utilizados para detectar um anticorpo de interesse. Estes estudos foram excluídos aplicações clínicas devido à baixa precisão e tempo de consumo decorrentes das complicações decorrentes do uso de antígeno / anticorpos. 1,3 crescente atenção centrou-se na detecção de moléculas pequenas (menos de 1 kg / mol) de biomédica , alimentos e interesse ambiental, além de segurança nacional. 29 Os exemplos mais conhecidos de dispositivos biossensores são monitores de glicose de auto-teste, que têm tela impressa eletrodos enzimáticos acoplados a um metro amperometric bolso. Estes sistemas utilizam tipicamente um método coulométrico onde a quantidade total de carga gerada pela reacção de oxidação da glicose é medida ao longo de um período de tempo. Dispositivos mobiliários deve ser portátil, robusto e de mão de fazer uso fácil para a população em geral.

Tag Redox como ferrocene são necessry para proporcionar a detecção eletroquímica de biomarcadores ou pequenas moléculas em solução como a maioria dos biomarcadores não são intrinsecamente eletroquimicamente ativa. 30-38 Ferroceno é uma molécula organometallic que é um padrão-ouro para eletroquímica, o que o torna uma excelente opção para a integração em biossensores eletroquímicos. Espécies ativas redox à base Ferroceno já acumulou considerável atenção devido ao seu pequeno tamanho, boa estabilidade, acesso sintético conveniente, modificação química fácil, lipofilicidade relativa, e facilidade de ajuste redox. 3,30-42 Pequenas moléculas baseado no núcleo ferrocene tem sido amplamente utilizado como detectores de íons metálicos e pequenas moléculas. 32-38,43 Sistemas dirigidas a espécies maiores, como biomoléculas têm utilizado a ligação de anticorpos grandes ou imunoglobulinas para derivados do ferroceno que foram incorporados em uma superfície eletroquímica. 1,3,39 , 44 Em cada caso, o potencial de corrente e intensity do par redox Fe III / Fe II foi alterado por acoplamento molecular, produzindo, assim, um novo identificador espectroscópica indicando a presença da molécula de analito. Esta mudança surge a partir da sobreposição extensiva que ocorre entre o sistema-pi dos anéis ciclopentadienilo e os de ferro orbitais d. Se o sistema pi é modificado, ou seja, derivado ou reagir, em seguida, a interacção orbital, por sua vez, a mudança. Isto irá afectar o núcleo Fe e pode ser observada como uma mudança no potencial do par Fe III / Fe II. 40,45,46 Estas propriedades tornam um tal sistema atractivo para uso como um agente de quantificação em um imunoensaio electroquímico ou biossensor.

De modo a produzir sistemas de ferroceno contendo capacidades específicas para biossensores é óptima para modificar um anel de Cp com a bio-receptor específico para uma molécula alvo e utilizar o outro anel de Cp como uma amarra molecular para a leitura electroquímica ou electrode (Figura 1). Síntese destes derivados do ferroceno assimétricos é desafiado por reações colaterais e a formação de espécies diméricas e poliméricas formadas sobre intermolecular cross-linking. 47 No entanto, o acoplamento química produzindo uma ligação amida é o caminho mais direto para fornecer derivados simples de ferrocene envolvendo componentes biológicos tais como péptidos e seus metabolitos. Portanto, as técnicas de fase sólida primeiro desenvolvidos na década de 1950 por Merrifield de síntese de péptidos podem ser aplicados a compostos organometálicos contendo ferroceno. Através da utilização da molécula de ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico ortogonalmente substituído, um sistema de ferroceno, que pode incluir uma porção do receptor (biotina), leitura electroquímica (ferroceno), e o componente de imobilização-ligante (cisteína) possui Foram construídas aqui detalhado. A síntese deste bio-conjugado é discutido bem como prova para a imobilização sobre uma superfície de ouro. Este trabalho represenst a primeira apresentação de um sistema composto de biotina, ferroceno e um aminoácido para a imobilização sobre uma superfície de ouro.

Protocol

1. Síntese de biotina-Fc-cisteína (1) Métodos em fase sólida para produzir resina-1 ligado. Coloque biotina resina carregada (250 mg, 0,145 mmol) para uma seringa de vidro sinterizado e inchar a resina através da elaboração de dimetilformamida (5 mL) e agitando a seringa num agitador de laboratório durante 20 min. Expelir a solução e repetir dimetilformamida inchaço mais uma vez. Remover o grupo protector Fmoc por adição de 4-6 ml de 20% de piperidina em dimeti…

Representative Results

A forma ligada resina de 1 é mostrada na Figura 2. A ligação covalente do componente ferroceno dá origem a uma coloração laranja para as pérolas de resina que é persistente com lavagem contínua e indicativo de um complexo de ferro contendo imobilizada em oposição a absorção de ferro pela PEG componente da esfera de resina. A forma livre da resina-1 é idêntica em cor para as pérolas de resina. A seguir à remoção do composto a partir da resina-esferas, …

Discussion

A síntese de derivados de ferroceno assimétricas é um desafio em solução. Por exemplo, as tentativas para produzir uma solução em resultou em baixos rendimentos do produto desejado (menos de 20%). Do mesmo modo, reacções que utilizam ácido carboxílico 1'-amino-ferroceno (sans Fmoc) e biotina ligada resina resultou em um produto insolúvel consistente com o produto polimerizado relatado por Baristic et al. e produto mínima. 47 Isto é ainda mais complicada pel…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

KG foi apoiada pela concessão P-1760 RA Fundação Welch, TCU Andrews Instituto de Matemática e Ciências da Educação (para KG), TCU pesquisa e criatividade Atividade Grant (a KG) e TCU SERC Grant (a JHS).

Materials

Biotin Novatag Resin NovaBiochem 8550510001
TORVIQ 10ML LUER LOCK FRITTED SYRINGE Fisher NC9299151
piperdine Acros P/3520/PB05
ninhydrin test Sigma-Aldrich 60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid Omm Scientific Special Order
1-​Hydroxybenzotriazole hydrate Sigma-Aldrich 157260-25G
N,N′-Diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407-5G
N,N-​Diisopropylethylamine Sigma-Aldrich 496219-100ML
Fmoc-Cys(Trt)-OH Novabiochem 8520080025
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T5408
1,2-ethanedithiol Sigma-Aldrich 2930
triisopropyl silane Sigma-Aldrich 233781
Eppendorf tubes (20 mL) any source
methanol any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dichloromethane any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dimethylformamide any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
centrifuge any source

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Scarborough, J. H., Gonzalez, P., Rodich, S., Green, K. N. Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology. J. Vis. Exp. (97), e52399, doi:10.3791/52399 (2015).

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