Summary

Méthodologie synthétique pour asymétrique Ferrocene dérivés Systems Bio-conjugués via solide méthodologie à base de résine de phase

Published: March 12, 2015
doi:

Summary

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Abstract

Une détection précoce est la clé de la réussite du traitement de la plupart des maladies, et il est particulièrement indispensable pour le diagnostic et le traitement de nombreux types de cancer. Les techniques les plus courantes sont utilisées modalités d'imagerie telles que imagerie par résonance magnétique (IRM), par émission de positrons Topographie (PET), et calculé Topographie (CT) et sont optimales pour la compréhension de la structure physique de la maladie, mais ne peuvent être effectués une fois tous les quatre à six semaines en raison de l'utilisation d'agents d'imagerie et le coût global. Dans cet esprit, le développement de «point de service» techniques, telles que biocapteurs, qui évaluent le stade de la maladie et / ou l'efficacité du traitement dans le bureau du clinicien et le faire d'une manière opportune, allait révolutionner les protocoles de traitement. 1 Comme un moyen d'exploration de base de ferrocène biocapteurs pour la détection de molécules d'intérêt biologique 2, des méthodes ont été développées pour produire des bio-conjugués du ferrocène-biotine décrits ici. Ce rapport mettra l'accent sur un système biotine-ferrocène-cystéine qui peut être immobilisé sur une surface d'or.

Introduction

Biocapteurs sont de petits appareils qui utilisent la technologie de reconnaissance biomoléculaire comme plate-forme pour l'analyse sélective et sont utilisés pour leur spécificité, la vitesse et à faible coût. Biocapteurs électrochimiques pour la détection de biomolécules sont à la pointe de ce domaine en raison de leur simplicité, de l'efficacité des coûts, et une sensibilité élevée. 1,3 L'anatomie générale de ces capteurs est une électrode équipé d'une molécule de reconnaissance spécifique pour le marqueur biologique d'intérêt . La liaison du marqueur biologique par la molécule de reconnaissance se traduit par un changement local de potentiel ou de courant qui peut être détecté par une simple mesure. Jusqu'à présent, le fragment de reconnaissance peut varier de enzymes, anticorps 4-8, 9-12, 13-16 cellules entières récepteurs, 17-20 21-23 peptides et d'ADN 24 et ont largement porté sur grosses molécules biologiques. 25-28 de recherche efforts dans ce domaine se sont concentrés principalement sur immunocapteurs WHere une immunoglobuline est immobilisée avec un noyau actif redox (tel que le ferrocène) et utilisé pour détecter un anticorps d'intérêt. Ces études ont été exclus des applications cliniques en raison d'une mauvaise précision et la consommation de temps découlant des complications découlant de l'utilisation de l'antigène / anticorps. 1,3 Une attention croissante a mis l'accent sur ​​la détection de petites molécules (moins de 1 kg / mol) de la recherche biomédicale , de la nourriture et de l'intérêt de l'environnement, en plus de la sécurité nationale. 29 Les exemples les plus connus de dispositifs de biocapteurs sont auto-test moniteurs de glucose, qui ont sérigraphiées électrodes enzymatiques couplés à un mètre ampérométrique poche. Ces systèmes utilisent généralement une méthode coulométrique où la quantité totale de charge générée par la réaction d'oxydation du glucose est mesurée sur une période de temps. Dispositifs de placement doivent être portable, robuste et de la main-lieu de faire usage facile pour la population en général.

Balises d'oxydoréduction telles que ferrocène sont nécesry de fournir la détection électrochimique de biomarqueurs ou de petites molécules en solution comme la plupart des biomarqueurs ne sont pas intrinsèquement électrochimiquement active. 30-38 Ferrocene est une molécule organométallique qui est une norme d'or pour l'électrochimie, ce qui en fait un excellent choix pour l'intégration dans des biocapteurs électrochimiques. espèces actives redox à base de ferrocène-ont déjà attiré l'attention considérable en raison de leur petite taille, une bonne stabilité, un accès synthétique pratique, modification chimique facile, lipophilie relative, et la facilité de réglage redox. 3,30-42 petites molécules basé sur le noyau de ferrocène ont été largement utilisés comme détecteurs d'ions métalliques et de petites molécules. 32-38,43 systèmes de ciblage tels que les espèces plus grandes biomolécules ont utilisé la fixation d'anticorps ou d'immunoglobulines grandes aux dérivés du ferrocene qui ont été intégrés sur une surface électrochimique. 1,3,39 , 44 Dans chaque cas, l'intensification potentielle et actuelleté du couple redox Fe III / Fe II a été modifié lors du couplage moléculaire, produisant ainsi une nouvelle poignée spectroscopique indiquant la présence de la molécule d'analyte. Cette variation résulte de l'étendue de chevauchement qui se produit entre le système pi-des noyaux cyclopentadiényle et les orbitales d de fer. Si le système de PI est modifiée, ce est à dire, dérivé ou réagi, puis l'interaction orbitale, à son tour, le changement. Ceci affectera le noyau Fe et peut être observé comme un changement dans le potentiel du couple Fe III / Fe II. 40,45,46 Ces propriétés rendent un tel système attractif pour une utilisation en tant qu'agent de quantification dans un dosage immunologique ou électrochimique biocapteur.

Afin de produire des systèmes de ferrocène contenant spécifiques pour les capacités de biocapteurs il est optimal pour modifier une bague de Cp avec le bio-récepteur spécifique pour une molécule cible et d'utiliser l'autre anneau Cp comme une attache moléculaire pour la lecture électrochimique ou electrode (Figure 1). La synthèse de ces dérivés de ferrocene asymétriques est contestée par des réactions secondaires et la formation d'espèces dimères et polymères formés par réticulation intermoléculaire. 47 Toutefois, le couplage chimie produisant une liaison amide est la route la plus directe pour fournir des dérivés simples de ferrocène impliquant composants biologiques tels que des peptides et de leurs métabolites. Par conséquent, les techniques de première phase solide développés dans les années 1950 par Merrifield pour la synthèse peptidique peuvent être appliquées à des composés organométalliques contenant du ferrocène. Grâce à l'utilisation de la molécule d'acide 1'-Fmoc-amino-ferrocène-1-carboxylique orthogonalement substitué, un système de ferrocène qui peut contenir un fragment de récepteur (biotine), lecture électrochimique (ferrocène) et le composant de blocage de segment de liaison (cysteine) présente été construit et détaillé ici. La synthèse de ce bio-conjugué est traité ainsi que des preuves pour l'immobilisation sur une surface d'or. Ce représen de travailts la première présentation d'un système composé de biotine, ferrocène et un acide aminé pour l'immobilisation sur une surface d'or.

Protocol

1. Synthèse de biotine-Fc-cystéine (1) Des procédés en phase solide pour produire une résine liée. Placez biotine résine chargée (250 mg, 0,145 mmol) dans une seringue fritte et gonfler la résine par l'élaboration de diméthylformamide (5 ml) et en secouant la seringue sur un agitateur de laboratoire pendant 20 min. Expulser la solution et répéter diméthylformamide gonflement une fois de plus. Éliminer le groupe protecteur Fmoc en ajoutant 6/4 ml de pipér…

Representative Results

La forme liée de résine de 1 est représenté sur la Figure 2. La fixation covalente du composant de ferrocène donne lieu à une teinte orange sur les perles de résine qui est persistante avec lavage en continu et indicatif d'un fer immobilisé contenant le complexe plutôt que l'absorption du fer par le composant PEG de la perle de résine. La forme d'une sans résine est identique en couleur pour les billes de résine. Après l'élimination du comp…

Discussion

La synthèse des dérivés de ferrocene asymétriques est difficile en solution. Par exemple, les tentatives pour produire une solution dans abouti à de faibles rendements en le produit désiré (moins de 20%). De même, les réactions utilisant 1'-amino-ferrocene carboxylique (sans résine Fmoc) et la biotine lié conduit à un produit insoluble accord avec le produit polymérisé rapportée par Baristic et al. et le produit minime. 47 Ce est encore compliquée par le …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

KG a été soutenu par la Fondation RA Welch subvention P-1760, TCU Institut Andrews de mathématiques et de sciences de l'éducation (à KG), TCU recherche et la créativité Activité Grant (à KG) et TCU SERC Grant (à JHS).

Materials

Biotin Novatag Resin NovaBiochem 8550510001
TORVIQ 10ML LUER LOCK FRITTED SYRINGE Fisher NC9299151
piperdine Acros P/3520/PB05
ninhydrin test Sigma-Aldrich 60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid Omm Scientific Special Order
1-​Hydroxybenzotriazole hydrate Sigma-Aldrich 157260-25G
N,N′-Diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407-5G
N,N-​Diisopropylethylamine Sigma-Aldrich 496219-100ML
Fmoc-Cys(Trt)-OH Novabiochem 8520080025
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T5408
1,2-ethanedithiol Sigma-Aldrich 2930
triisopropyl silane Sigma-Aldrich 233781
Eppendorf tubes (20 mL) any source
methanol any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dichloromethane any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dimethylformamide any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
centrifuge any source

Referências

  1. Wang, J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosens Bioelectron. 21 (10), 1887-1892 (2006).
  2. Scarborough, J. H., Brusoski, K., Brewer, S., Green, K. N. . Solid phase synthesis of ferrocene-biotin bioconjugates and reactivity with avidin. A paradigm for development of electrochemical biosensors. , (2014).
  3. Zhang, S., Zheng, F., Wu, Z., Shen, G., Yu, R. Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film/gold nanoparticle amplification. Biosens Bioelectron. 24 (1), 129-135 (2008).
  4. Gobi, K. V., Mizutani, F. Layer-by-layer construction of an active multilayer enzyme electrode applicable for direct amperometric determination of cholesterol. Sensors and Actuators. 80 (3), 272-277 (2001).
  5. Gobi, K. V., Mizutani, F. Amperometric detection of superoxide dismutase at cytochrome c-immobilized electrodes: Xanthine oxidase and ascorbate oxidase incorporated biopolymer membrane for in-vivo analysis. Analytical Sciences. 17 (1), 11-15 (2001).
  6. Gobi, K. V., Sato, Y., Mizutani, F. Mediatorless superoxide dismutase sensors using cytochrome c-modified electrodes: Xanthine oxidase incorporated polyion complex membrane for enhanced activity and in vivo analysis. Electroanalysis. 13 (5), 397-403 (2001).
  7. Shankaran, D. R., Uehara, N., Kato, T. A metal dispersed sol-gel biocomposite amperometric glucose biosensor. Biosensor.., & Bioelectronics. 18 (5-6), 721-728 (2003).
  8. Yamamoto, K., Xu, F., Shi, G. Y., Kato, T. On-line biosensor for detection of glucose, choline and glutamate simultaneously integrated with microseparation system. Journal of Pharmacological Sciences. 91, 211p-211 (2003).
  9. Luppa, P. B., Kaiser, T., Cuilleron, C. Y. Ligand-binding studies of sex hormone-binding globulin with 17alpha-dihydrotestosterone derivatives as ligands using a surface plasmon resonance biosensor. Clinical Chemistry. 47 (6), A9-A9 (2001).
  10. Luppa, P. B., Sokoll, L. J., Chan, D. W. Immunosensors – principles and applications to clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 314 (1-2), 1-26 (2001).
  11. Mallat, E., Barcelo, D., Barzen, C., Gauglitz, G., Abuknesha, R. Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 20 (3), 124-132 (2001).
  12. Pemberton, R. M., Hart, J. P., Mottram, T. T. An electrochemical immunosensor for milk progesterone using a continuous flow system. Biosensor.., & Bioelectronics. 16 (9-12), 715-723 (2001).
  13. Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, W., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Annals of Biomedical Engineering. 27 (6), 697-711 (1999).
  14. May, K. M. L., Wang, Y., Bachas, L. G., Anderson, K. W. Development of a whole-cell-based biosensor for detecting histamine as a model toxin. Analytical Chemistry. 76 (14), 4156-4161 (2004).
  15. Taylor, C. J., Bain, L. A., Richardson, D. J., Spiro, S., Russell, D. A. Construction of a whole-cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate. Analytical Biochemistry. 328 (1), 60-66 (2004).
  16. Philp, J. C., et al. Whole cell immobilised biosensors for toxicity assessment of a wastewater treatment plant treating phenolics-containing waste. Analytica Chimica Acta. 487 (1), 61-74 (2003).
  17. Subrahmanyam, S., Piletsky, S. A., Turner, A. P. F. Application of natural receptors in sensors and assays. Analytical Chemistry. 74 (16), 3942-3951 (2002).
  18. Ryberg, E., et al. Identification and characterisation of a novel splice variant of the human CB1 receptor. Febs Letters. 579 (1), 259-264 (2005).
  19. Cooper, M. A. Advances in membrane receptor screening and analysis. Journal of Molecular Recognition. 17 (4), 286-315 (2004).
  20. Kumbhat, S., et al. A novel receptor-based surface-plasmon-resonance affinity biosensor for highly sensitive and selective detection of dopamine. Chemistry Letters. 35 (6), 678-679 (1246).
  21. Yemini, M., Reches, M., Gazit, E., Rishpon, J. Peptide nanotube-modified electrodes for enzyme-biosensor applications. Analytical Chemistry. 77 (16), 5155-5159 (2005).
  22. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77 (21), 6976-6984 (2005).
  23. Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21 (10), 1192-1199 (2003).
  24. Piunno, P. A. E., Krull, U. J. Trends in the development of nucleic acid biosensors for medical diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (5), 1004-1011 (2005).
  25. Dechtrirat, D., et al. Electrochemical displacement sensor based on ferrocene boronic acid tracer and immobilized glycan for saccharide binding proteins and E. coli. Biosensor.., & Bioelectronics. 58, 1-8 (2014).
  26. Lacina, K., et al. Combining ferrocene, thiophene and a boronic acid: a hybrid ligand for reagentless electrochemical sensing of cis-diols. Tetrahedron Letters. 55 (21), 3235-3238 (2014).
  27. Takahashi, S., Anzai, J. Recent Progress in Ferrocene-Modified Thin Films and Nanoparticles for Biosensors. Materials. 6 (12), 5742-5762 (2013).
  28. Liu, L., et al. Amplified voltammetric detection of dopamine using ferrocene-capped gold nanoparticle/streptavidin conjugates. Biosensor.., & Bioelectronics. 41, 730-735 (2013).
  29. Shankaran, D. R., Gobi, K. V. A., Miura, N. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest. Sensors and Actuators B-Chemical. 121 (1), 158-177 (2007).
  30. Szarka, Z., Kuik, &. #. 1. 9. 3. ;., Skoda-Földes, R., Kollár, L. Aminocarbonylation of 1,1′-diiodoferrocene, two-step synthesis of heterodisubstituted ferrocene derivatives via homogeneous catalytic carbonylation/coupling reactions. Journal of Organometallic Chemistry. 689 (17), 2770-2775 (2004).
  31. Niu, H. T., et al. Imidazolium-based macrocycles as multisignaling chemosensors for anions. Dalton Trans. (28), 3694-3700 (2008).
  32. Qing, G. -. Y., Sun, T. -. L., Wang, F., He, Y. -. B., Yang, X. Chromogenic Chemosensors forN-Acetylaspartate Based on Chiral Ferrocene-Bearing Thiourea Derivatives. European Journal of Organic Chemistry. (6), 841-849 (2009).
  33. Romero, T., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A multiresponsive two-arm ferrocene-based chemosensor molecule for selective detection of mercury. Dalton Trans. (12), 2121-2129 (2009).
  34. Zapata, F., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A selective redox and chromogenic probe for Hg(II) in aqueous environment based on a ferrocene-azaquinoxaline dyad. Inorg Chem. 48 (24), 11566-11575 (2009).
  35. Alfonso, M., Tarraga, A., Molina, P. Ferrocene-based multichannel molecular chemosensors with high selectivity and sensitivity for Pb(II) and Hg(II) metal cations. Dalton Trans. 39 (37), 8637-8645 (2010).
  36. Zapata, F., Caballero, A., Molina, P., Tarraga, A. A ferrocene-quinoxaline derivative as a highly selective probe for colorimetric and redox sensing of toxic mercury(II) cations. Sensors (Basel). 10 (12), 11311-11321 (2010).
  37. Thakur, A., Sardar, S., Ghosh, S. A highly selective redox, chromogenic, and fluorescent chemosensor for Hg2+ in aqueous solution based on ferrocene-glycine bioconjugates). Inorg Chem. 50 (15), 7066-7073 (2011).
  38. Sathyaraj, G., Muthamilselvan, D., Kiruthika, M., Weyhermüller, T., Nair, B. U. Ferrocene conjugated imidazolephenols as multichannel ditopic chemosensor for biologically active cations and anions. Journal of Organometallic Chemistry. 716, 150-158 (2012).
  39. Kwon, S. J., Kim, E., Yang, H., Kwak, J. An electrochemical immunosensor using ferrocenyl-tethered dendrimer. Analyst. 131 (3), 402-406 (2006).
  40. Pinto, A., Hoffmanns, U., Ott, M., Fricker, G., Metzler-Nolte, N. Modification with Organometallic Compounds Improves Crossing of the Blood-Brain Barrier of [Leu(5)]-Enkephalin Derivatives in an In Vitro Model System. Chembiochem. 10 (11), 1852-1860 (2009).
  41. Barisic, L., et al. The first ferrocene analogues of muramyldipeptide. Carbohydr Res. 346 (5), 678-684 (2011).
  42. Brusoski, K., Green, K. N. Novel click derivatives of ferrocene and their applications toward construction of electrochemical biosensors. Abstracts of Papers, 243rd ACS National Meetin.., & Exposition. , (2012).
  43. Bucher, C., Devillers, C. H., Moutet, J. -. C., Royal, G., Saint-Aman, E. Anion recognition and redox sensing by a metalloporphyrin–ferrocene–alkylammonium conjugate. New Journal of Chemistry. 28, 1584-1589 (2004).
  44. Tanaka, S., Yoshida, K., Kuramitz, H., Sugawara, K., Nakamura, H. Electrochemical detection of biotin using an interaction between avidin and biotin labeled with ferrocene at a perfluorosulfonated ionomer modified electrode. Analytical Sciences. 15 (9), 863-866 (1999).
  45. Real-Fernandez, F., et al. Ferrocenyl glycopeptides as electrochemical probes to detect autoantibodies in multiple sclerosis patients’ sera. Biopolymers. 90 (4), 488-495 (2008).
  46. Husken, N., Gasser, G., Koster, S. D., Metzler-Nolte, N. Four-potential’ ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry. Bioconjug Chem. 20 (8), 1578-1586 (2009).
  47. Barisic, L. . Croatica Chemica Acta. 75, 199-210 (2002).
  48. Kirin, S. I., Noor, F., Metzler-Nolte, N. Manual Solid-Phase Peptide Synthesis of Metallocene–Peptide Bioconjugates. Journal of Chemical Education. 84 (1), 108-111 (2007).
  49. Barisic, L., et al. Helically chiral ferrocene peptides containing 1 ‘-aminoferrocene-1-carboxylic acid subunits as turn inducers. Chemistry-a European Journal. 12 (19), 4965-4980 (2006).
  50. Mahmoud, K., Long, Y. -. T., Schatte, G., Kraatz, H. -. B. Electronic communication through the ureylene bridge: spectroscopy, structure and electrochemistry of dimethyl 1′,1′-ureylenedi(1-ferrocenecarboxylate). Journal of Organometallic Chemistry. 689 (13), 2250-2255 (2004).
  51. Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. Synthesis and electrochemical investigation of oligomeric ferrocene amides: Towards ferrocene polyamides. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials. 16 (3), 201-210 (2006).
  52. Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. A bioorganometallic approach for the electrochemical detection of proteins: A study on the interaction of ferrocene-peptide conjugates with papain in solution and on au surfaces. Chemistry-a European Journal. 13 (20), 5885-5895 (2007).
check_url/pt/52399?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Scarborough, J. H., Gonzalez, P., Rodich, S., Green, K. N. Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology. J. Vis. Exp. (97), e52399, doi:10.3791/52399 (2015).

View Video