Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухоли головного мозга и приводит к летальному исходу. Хирургическая резекция в сочетании с неспецифической стандарт медицинской помощи химиотерапии и лучевой терапии не удается полностью устранить злокачественные клетки, в результате чего плохим прогнозом менее 15 месяцев у пациентов с этим заболеванием ^1. В отличие от этого, иммунотерапия предлагает точный подход специально для ориентации опухолевые клетки, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы служить в качестве весьма эффективного лечения платформе с уменьшенным риском побочного токсичности ^2-4. Т-клетки инженерии экс естественных условиях, чтобы выразить химерных рецепторов антигена (автомобили) предлагают универсальный стратегии иммунотерапии опухолей. ЦАР формируются путем слияния внеклеточный вариабельный участок антитела с сигнальной молекулы одного или более внутриклеточный Т-клеток (ов), вместо полноразмерного главного комплекса гистосовместимости (MHC) -ограниченных Т-клеточный рецептор ^5. Этот режим антитело-антиген, как ждут победитна позволяет реактивные антиген-специфические Т-клетки, чтобы распознавать и реагировать на опухолевых антигенов в отсутствие МНС и может быть адаптирована для практически бесконечного антигена репертуара.

CAR Т-клетки инженерии против различных опухолевых антигенов показали доклинические эффективность и высокую обещание в клинике ^6-9. В частности, в контексте GBM, ориентации АВТОМОБИЛЯ Т платформа клеток рецептор эпидермального фактора роста вариант III (EGFRvIII), мутация опухоли конкретных экспрессируется на клеточной поверхности ^10, как было показано, продлить выживание в глиомы мышей, несущих ^11. Несмотря на универсальность, однако, клиническая польза CAR приемной терапии не были полностью реализованы, отчасти из-за опухоли связано иммуносупрессии и иммунной уклонения ^12-16, а также проблемы в установлении и поддержании антиген-специфические Т-клетки в живом организме. Используя стандарт медицинской помощи (SoC) с иммунотерапии потенциально может преодолеть некоторые из этих лимитации, приводит к повышению эффективности в обоих доклинических и клинических условиях.

SOC для Пострезекционные GBM состоит из высоких доз темозоломида (ТМЗ), ДНК алкилирующим агентом ^17, и облучения всего головного мозга (ИВБ) ^1. Эти процедуры, как предполагается, быть согласованы с противоопухолевых вакцин с помощью повышающей регуляции опухолевого МНС выражения ^18-20 и пролития антигенов мертвых опухолевых клеток ^17,19,21,22. Действительно, добавление ТМЗ ^20,23 или ^18,24 ИВБ приводит к повышенной противоопухолевой эффективности иммунных основе процедуры в доклинических настройки. Кроме того, как много неспецифических цитотоксических химиотерапевтических, ТМЗ, как известно, вызывают системное лимфопения ^25,26, которые могут быть использованы в качестве средства принимающей кондиционирования для приемных платформ терапии ^27-29. ТМЗ-опосредованной lymphodepletion было показано, что повышение частоты и функцию антиген-специфических Т-клеток, что приводит к увеличению эффективности в adopный платформа терапия против внутричерепных опухолей ^30. В контексте CAR терапии, lymphodepletion служит в качестве средства для кондиционирования принимающей стороны и уменьшения количества эндогенного супрессоров Т-клеток ³¹ и индуцирующий пролиферацию гомеостатической ³² с помощью пониженном конкуренции за цитокинов ^33, таким образом, повышение противоопухолевой активностью ^11,34. Учитывая синергетический отношения между GBM ШОС и иммунотерапии платформ, оценивая новые приемных терапии и платформы вакцины в контексте ШОС имеет решающее значение для привлечения значимых выводов относительно эффективности.

В этом протоколе мы опишем метод генерации и внутривенного введения мышиных EGFRvIII-конкретного автомобиля Т-клеток наряду с TMZ и ИВБ в мышей, несущих EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей (рис 1 для лечения сроки). Вкратце, CAR Т-клетки сделаны экс естественных условиях на ретровируса трансдукции. Человек эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки трансфицируют с использованием ДНК / липидный комплекс (содержащий вектор машину и PCL-Eco плазмиды), чтобы получить вирус, который затем используется для трансдукции активированных мышиных спленоцитов, которые собирали и культивировали в параллель. В ходе поколение автомобиля, мышиные хозяева, несущие EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей вводят фракционированного всего головного мозга рентгеновского излучения и системное лечение ТМЗ в дозах, сопоставимых с клинической SOC. CAR Т-клетки затем доставляются внутривенно lymphodepleted хозяев.

Следующая процедура описана в семи отдельных фаз: (1) Администрация Темозоламид для мышей с опухолями, (2) весь мозг Облучение опухоли мышей (3) трансфекции, (4) спленэктомия и Т-клеток Подготовка, (5 ) трансдукция, (6) Культура CAR Т-клеток и урожай, и (7) управление CAR Т-клеток в опухоли мышей. Эти фазы состоят из нескольких этапов, которые охватывают 6-7 дней и выполняются одновременно.