La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport

La linfa fluisce dal piccolo intestino attraverso un processo unidirezionale che origina a singoli lacteals che sono contenuti all'interno di ogni piccola villi intestinali ^1. Lacteals sono relativamente permeabile ai fluidi, macromolecole e cellule e la formazione della linfa quindi inizia con l'ingresso di questi fattori in lacteals. La linfa iniziale nei lacteals scorre successivamente dall'intestino tramite una rete di microvasi linfatici, raccolta (afferente) vasi linfatici, una serie di linfonodi mesenterici e, infine, i post-nodale (efferenti) vasi linfatici. Nei nodi, linfa passa attraverso una serie di seni midollari dove avviene lo scambio con le cellule immunitarie nodo residenti nonché materiale che entrano nodo dal sangue. Tutte linfa scorre dal piccolo intestino eventualmente converge nel dotto efferente linfa mesenterica superiore e successivamente il chyli cisterna. Il chyli cisterna raccoglie anche linfodrenante tessuti periferici caudali, intestinale, regioni epatiche e lombari e si unisce al dotto linfatico toracico con la linfa del mediastino e parti del cranio del corpo. Il dotto linfatico toracico svuota linfa direttamente nel sistema venoso a livello della giunzione delle vene giugulari e succlavia sinistra interna. Il protocollo qui descritto, che consente la raccolta di linfa direttamente dal condotto mesenterico linfatico superiore, facilita quindi l'analisi di vari fattori che transitano direttamente dall'intestino al (generale) circolazione sistemica attraverso il sistema linfatico intestinale.

Le principali funzioni fisiologiche assegnate al sistema linfatico intestinale sono di mantenere l'equilibrio dei fluidi, per facilitare l'assorbimento dei lipidi e molecola lipofila, e per consentire opportune risposte immunitarie ^1. Le cellule tumorali e virus si propagano anche attraverso i vasi linfatici intestinali ^2-4 e principali cambiamenti si verificano all'interno dei vasi linfatici in diverse patologie infiammatorie e metaboliche ^5-7. Lattinanulation del condotto linfatico mesenterico per raccogliere linfa nel mesentere consente un'analisi del flusso di fluido di massa attraverso i vasi linfatici intestinali e quantificazione del tasso di concentrazione e trasporto di varie cellule e molecole. Modifiche alla concentrazione o di transito di questi fattori in risposta alle varie sfide (ad esempio, diete, antigeni, farmaci) e in modelli di malattia (ad esempio, colite, HIV, diabete) possono anche essere valutate. Sebbene sia impossibile descrivere ampiamente ogni componente linfa che possono essere analizzati e confrontati qui, linfonodi mesenterici consiste semplicisticamente di acquosa, lipidi e fasi cellulari. I componenti di interesse nella fase acquosa includono peptidi e proteine, come antigeni o tolerogens ^8, messaggeri del sistema immunitario come le citochine e mediatori dei mastociti ^9, e mediatori metaboliche come incretine ^10. La frazione cellulare del mesenterico linfatico post-nodale consiste quasi interamente (oltre il 99%) di lymphocytES ^11. Varie cellule immunitarie (cellule dendritiche, mastociti, ecc) entrano nei vasi linfatici mesenterici pre-nodali, ma rimangono all'interno del nodo ^12. Se le cellule all'interno afferente linfa sono di interesse, è possibile raccogliere queste cellule mediante la rimozione della linfa mesenterica nodi diversi giorni prima cannulazione del condotto linfatico mesenterico ^12. In questo modo i condotti linfatici afferenti ed efferenti sono direttamente collegati e le cellule linfatici afferenti linfa passano direttamente nel condotto linfa mesenterica. Il transito e il fenotipo delle varie cellule immunitarie che passano attraverso i vasi linfatici intestinali possono quindi essere esaminati. Forse il motivo più comune citato per la raccolta della linfa mesenterica fino ad oggi, tuttavia, è quello di studiare la trasformazione intestinale, l'assorbimento e il trasporto dei lipidi alimentari e molecole lipofile ^10.

Dopo ingestione, lipidi alimentari sono digeriti (ad esempio, da trigliceridi di acidi grassi e monogliceridi, phospholipid di acidi grassi e lysophospholipid e esteri del colesterolo ad acidi grassi e colesterolo, ecc) e dispersi nel lume intestinale in piccola micelle e strutture vescicolari tramite l'aggiunta di anfifili di bile (fosfolipidi, sali biliari e colesterolo) e l'azione di enzimi pancreatici ^10,13. Da qui essi vengono assorbiti nel enterociti. Una parte dei componenti sono assorbiti riesterificati per formare trigliceridi, fosfolipidi e gli esteri del colesterolo nelle cellule assorbenti (enterociti). Questi lipidi riesterificati sono costituiti da una combinazione di esogenamente ingerito componenti lipidici e dei componenti lipidici endogeni dalla bile secreta, piscine lipidici mucosa intestinale o fornitura di sangue ^13. Da qui i lipidi esterificati o sono memorizzate all'interno di enterociti o assemblati in lipoproteine ​​intestinale (chilomicroni, lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL)) insieme a varie apoproteine ​​e altre molecole lipofile ( <em> per esempio, vitamine) ^10,13. Dopo l'uscita enterociti, lipoproteine ​​sono specificamente trasportati dall'intestino nella circolazione sistemica attraverso il sistema linfatico mesenterico le lacteals intestinali sono più permeabili al loro ingresso di capillari sanguigni intestinali. Una parte dei componenti lipidici assorbiti vengono anche trasportati dall'intestino alla circolazione sistemica attraverso i capillari sanguigni e della vena porta, come singolo, non-lipoproteine ​​associati, molecole ^14. In generale, tuttavia, la via di trasporto vena porta è solo un operatore significativo l'assorbimento dei lipidi lunghezza della catena corta e media.

La raccolta della linfa mesenterica consente quindi la valutazione del trasporto delle lipoproteine ​​e componenti associati (lipidi, molecole lipofile, apo-proteine) dall'intestino. Le lipoproteine ​​possono essere quantizzati e caratterizzati con il vantaggio che lipoproteine ​​linfonodi mesenterici, in generale, sono in un nascenStato t poiché non sono stati ampiamente modificati da enzimi sistemici come lipoproteina lipasi ^15. Mentre la linfa mesenterica modello di ratto cannulato è forse storicamente più ampiamente descritto per l'analisi del trasporto di lipidi / lipoproteine ​​dall'intestino, una zona di espansione interesse è il ruolo dei linfatici nel trasporto di farmaci lipofili, profarmaci e altri xenobiotici ^13,16 che è al centro del modello qui descritto. Farmaci lipofili (generalmente quelli con log P> 5 e solubilità in catena lunga trigliceridi> 50 mg / g, anche se eccezioni sono evidenti) ^17,18, profarmaci ¹⁹ e altri xenobiotici ^13,16 può accedere ai vasi linfatici intestinali passivamente o da integrando attivamente in lipoproteine ​​intestinale vie di trasporto ^19.

Il ratto linfa mesenterica tecnica incannulamento ha quindi molte applicazioni. Bollman et al. Primo descrisse una technique per cannulare condotto linfa mesenterica nei ratti nel 1948 ^20. Da allora una serie di variazioni sul modello sono state descritte. Ad esempio, la raccolta si può verificare quando il ratto è anestetizzato con diversi anestetici ^21,22, o in stato cosciente, mentre trattenuto ¹⁵ o liberamente in movimento ^23,24. I ratti possono essere somministrati diverse soluzioni reidratanti e di altre sostanze come i lipidi e le formulazioni di farmaci a prezzi diversi nello stomaco, l'intestino o parenterale (in genere 0-5 ml / h) ^25. In alcuni studi dotto linfatico toracico piuttosto che condotto linfatico mesenterico è cannulati stimare trasporto dall'intestino attraverso i vasi linfatici anche se questo può sovrastimare transito dal piccolo intestino, a seconda del fattore di interesse, come il dotto linfatico toracico riceve anche linfatico da altri regioni ^22,26. Modelli incannulamento linfonodi sono stati descritti in numerose altre specie, tra cui topi ^15,27, mini-pigs ^12, pecore ^28,29, maiali e cani ^{30 31.} Tuttavia, il modello di ratto è il più ampiamente e costantemente citata. Protocolli dettagliati per l'incannulamento della condotta della linfa mesenterica seguita dalla raccolta di linfa in conscia ²⁵ o anestetizzato ²² ratti e topi ^15,27 sono stati pubblicati in precedenza e il lettore interessato è rivolta a questi protocolli. Questo protocollo è il primo a dimostrare la tecnica in un formato visualizzato.

La linfa cannulata modello murino ha dei vantaggi rispetto ai modelli animali di maggiori dimensioni in termini di costi, la facilità di chirurgia e le considerazioni etiche. Rispetto al modello di topo, mesenterica chirurgia incannulazione linfatico è anche più facile nel ratto, anche se il modello del mouse consente studi più approfonditi sugli animali transgenici ^27. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del modello di ratto, in particolare quelle legate a differenze nella fisiologia, tale limite extrapolatione ad altre situazioni pre-clinici e clinici. Ad esempio, nel flusso di ratto biliare è costante ed indipendente dall'assunzione di cibo che negli alimenti specie superiore o lipidi stimolano flusso biliare ^32. Questo crea problemi per ottenere rappresentanza ambienti pre e post-prandiale nel ratto che riflettono ciò che si vede in specie più grandi e gli esseri umani. Per gli studi di somministrazione di farmaci, specie più grandi possono anche essere preferito al momento della valutazione del trasporto linfatico dopo la somministrazione di dosi realistico umano forma ^25. In un recente studio, prezzi di trasporto dei lipidi nella linfa mesenterica sono risultati comparabili tra le specie (topo, ratto, cane) dopo la somministrazione di una massa equivalente e il tipo di lipidi che fornisce una certa fiducia in estrapolando i dati di trasporto dei lipidi tra le specie ^27. Tuttavia, il trasporto di un modello lipofilo droga, alofantrina, ordinati in ordine di grandezza animale (cioè, cane> rat> mouse). Un fattore di scala può quindi essere richiesto di extrapolate dati sul trasporto di droga linfatici da topo ad altre specie.

Una limitazione di modelli linfatico cannulazione, in generale, è che la raccolta della linfa passiva direttamente da un condotto linfatico può modificare il flusso linfatico e trasporto dal vasi linfatici funzionano contro un gradiente di pressione che viene alterata quando il vaso è cannulata ^33. Il modello linfa incannulamento può anche essere difficile stabilire in laboratori che non hanno familiarità con la tecnica. Sono stati così descritto modelli alternativi. Per esempio, il transito di fattori attraverso il sistema linfatico intestinale, come lipoproteine ​​e molecole lipofile, è stata studiata indirettamente tramite la raccolta di sangue. Un tale modello prevede confrontando concentrazioni ematiche di lipidi e / o farmaci dopo somministrazione orale in presenza e in assenza di inibitori (ad esempio, colchicina, Pluronic L81, cicloeximide) della produzione lipoproteine ​​intestinali che bloccano il trasporto ³⁴ linfatica. Un vantaggiodi modelli che quantificano il trasporto linfatico indirettamente tramite la raccolta di campioni di sangue è che permette una valutazione del trasporto linfatico negli esseri umani come la chirurgia invasiva, non è richiesto ^35. Tuttavia, gli inibitori del trasporto linfatico non sono specifici e fattori che sono trasportate attraverso i vasi linfatici sono diluiti e modificati nella circolazione sistemica che complica tali valutazioni. In vitro alternative sono stati descritti. Ad esempio, le culture Caco-2 cellulari o isolato enterociti sono stati utilizzati per studiare in modo più approfondito la secrezione intestinale di molecole che entrano i vasi linfatici ^36-38. Un modello avanzato in vitro che è più rappresentativo del microambiente intestinale umano è stato anche recentemente descritto ^39. In questo modello di uno strato di cellule endoteliali linfatico è co-coltura con cellule Caco-2 che consente un'analisi più dettagliata del trasferimento di sostanze dall'intestino nei vasi linfatici. Tuttavia, in vitro sistemi cellulari mancanza di flusso di scambio e di trasferimento, ossia l'interconnessione con un lume intestinale e sangue alla base e la fornitura vascolare linfatico. In un approccio alternativo, Kassis et al. Stabilito un doppio canale (campo chiaro ad alta velocità di video e fluorescenza) in situ sistema di imaging che permette di confronto quantitativo fra contrazione nave, il flusso linfatico e le concentrazioni di lipidi fluorescenti mesenterici vasi linfatici ^33. Un vantaggio di questo modello sopra citato de sistemi in vitro è che consente un monitoraggio accurato del passaggio di cellule immunitarie attraverso i vasi linfatici. Misurazioni assolute di lipidi massa (o droga) trasporto sono, tuttavia, non sono ancora stabiliti con metodi di imaging. In vitro e in silico approcci per prevedere in particolare la misura del trasporto di droga lipofila attraverso i vasi linfatici intestinali sono stati anche pubblicati ^40-42. Ad esempio, l'ex vivo affinità di vari compounds per chilomicroni plasma è risultato correlare ragionevolmente bene con il loro trasporto linfatico in vivo ^41. Successivamente, lo stesso gruppo ha stabilito un modello in silico per prevedere affinità farmaco per chilomicroni basate su più ^{di 40} proprietà fisico-chimiche. Holm et al. Anche stabilito un modello relativamente complessa in silico per prevedere definitiva trasporto linfatico di composti lipofilici sulla base di descrittori molecolari ^42. Questi modelli possono fornire un approccio utile prevedere l'ampiezza del trasporto linfatico droghe sconosciute. Validazione dei modelli con una vasta gamma di farmaci e tra i vari laboratori, tuttavia, è necessario per confermare la loro accuratezza e riproducibilità.

Incannulazione del condotto mesenterico linfatico rimane pertanto l'unico mezzo per esaminare direttamente il contenuto della linfodrenante tenue e il tasso di transito della complessa serie di fattori (cellule, proteine,peptidi, lipidi, farmaci) in linfa in una situazione in vivo. Qui si descrive un protocollo per incannulazione del dotto linfatico e carotide arteria mesenterica che consente la raccolta di linfa mesenterica e arteriosa sistemica da ratti anestetizzati. Dati rappresentativi dimostrano come il modello può essere utilizzato per esaminare lipidico e trasporto del farmaco dall'intestino attraverso il sistema linfatico mesenterico. Questa è seguita da una discussione di difficoltà che si possono incontrare nella definizione del modello e una guida alla risoluzione. Una volta stabilito il modello è un potente strumento per studiare il trasporto linfatico intestinale.