Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
Alterazioni dinamiche nel numero e la struttura delle sinapsi sono le caratteristiche distintive di sviluppo, l'invecchiamento, e numerose malattie neurodegenerative 1-3. La capacità dei neuroni di ricevere e integrare le informazioni sinaptica dipende morfologia dendritica e alterazioni dinamiche connessioni sinaptiche. Infatti, esiste una correlazione positiva tra spine dendritiche e il numero di sinapsi, che sia un impatto funzione cognitiva 4. Quindi, non è sorprendente che decrementi in numero spine dendritiche sono stati associati a disfunzioni cognitive in una serie di disturbi neurologici 5-7, spingendo grande interesse spine dendritiche quantificazione. Tuttavia, la quantificazione della densità delle spine rimane un lungo e noioso compito che non riesce a generare informazioni utili per quanto riguarda la topografia e la distribuzione delle sinapsi in tutto il albero dendritiche. Fortunatamente, metodi di colorazione (ad esempio, Golgi-Cox e doublecortin (DCX)), in combinatocon tecniche di imaging sofisticate può essere utilizzata per superare gli attuali ostacoli e di produrre immagini ad alta risoluzione di dendritica in modo affidabile e rapido. Mentre metodo di colorazione Golgi-Cox può essere implementato per valutare lo stato di dendritica in tutti i neuroni 8, DCX può essere implementato di etichettare i neuroni appena nati in particolare nel giro dentato e zona subventricolare 9, una considerazione importante dato che la neurogenesi si verifica in entrambi queste regioni in tutto il ciclo di vita 10,11.
Dopo la colorazione, due metodi di imaging sono stati dispiegati per valutare caratteristiche dendritiche: i) l'imaging in tempo reale (RTI) e ii) ha esteso la profondità di campo dell'imaging (EDFI). La tecnica RTI fornisce un mezzo per rintracciare e quantificare la lunghezza e ordine delle arborization lungo i singoli segmenti dendritiche e rami. Così permette di stimare la superficie totale e volume occupato da ciascun albero dendritico. Più specifically, nel metodo RTI l'utente identifica continuamente i segmenti e riorienta iterativamente il neurone tracciamento software raccoglie x, y, z e le coordinate della struttura dendritica e ricostruisce la traiettoria della struttura dendritica in 3D. Comparativamente, il metodo EDFI fornisce un mezzo piuttosto semplici e accelerate per valutare la densità dendritica in campioni di tessuto piuttosto spesse generando un'immagine composita, fornendo informazioni sull'intero asse z. Per fare ciò, l'utente registra file video ad alta definizione in tutto lo spessore della sezione e quindi utilizza il software per cercare i fotogrammi video per identificare i punti in cui un pixel è completamente a fuoco. Successivamente, i pixel mirati sono fusi e integrati in un ad alta risoluzione, immagini 2D composita. Questa immagine composita contiene tutti i pixel che sono stati in-fuoco indipendentemente dalla loro posizione nell'asse z. Analisi qualitativa e quantitativa di queste immagini 2D può essere utilizzato successivamente per determinare la densitàdi ramificazione dendritica in ogni campo.
Infine, vi presentiamo un metodo per la generazione di immagini panoramiche estremamente ad alta risoluzione per l'analisi e la valutazione dei dendriti in un'intera regione di interesse. Questa tecnica può essere impiegata per superare la mancanza di accesso a molto ad alta risoluzione e fotocamere digitali costose. Utilizzando questo metodo, si cattura immagini seriali in diverse località lungo la xey assi e quindi automaticamente punti insieme con un freeware (per esempio, immagine Composite Editor). In particolare, questo metodo può essere utilizzato per la valutazione qualitativa e quantitativa di dendritica in piuttosto ampio spazio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, due metodi sono stati descritti per quantificare l'entità del dendritica in neuroni maturi e appena nati con metodi di colorazione convenzionali in collaborazione con RTI e EDFI. L'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di neuroni fornisce un metodo estremamente utile per testare gli effetti deleteri di malattie neurodegenerative e, a sua volta, fornisce un mezzo per valutare strategie terapeutiche che colpiscono i neuroni ippocampali.
Mentre il metodo RTI stato utilizzat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Referências
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