Bedömning av dendritiska arborization i gyrus dentatus i hippocampus regionen hos möss
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
Dynamiska förändringar i antal och struktur synapser är kännetecknen för utveckling, åldrande, och många neurodegenerativa sjukdomar 1-3. Förmågan av nervceller för att ta emot och integrera synaptiska informationen beror på dendritiska morfologi och dynamiska förändringar i synapsförbindelser. Faktum finns ett positivt samband mellan dendritiska ryggraden och synaps nummer, vilket både påverkar kognitiv funktion 4. Det är alltså inte förvånande att minskningar i dendritiska ryggraden nummer har förknippats med kognitiv dysfunktion i ett antal neurologiska sjukdomar 5-7, vilket fick stort intresse dendritiska ryggraden kvantifiering. Ändå kvantifiering av ryggraden täthet förblir en tidskrävande och mödosam uppgift som misslyckas med att generera användbar information om topografi och distribution av synapser över dendritiska träd. Lyckligtvis färgningsmetoder (t.ex. Golgi-Cox och doublecortin (DCX)) tillsammansmed sofistikerade avbildningstekniker kan användas för att övervinna de nuvarande hindren och producera högupplösta bilder av dendritiska arborization på ett tillförlitligt och snabbt sätt. Medan Golgi-Cox färgningsmetoden kan användas för att bedöma tillståndet i dendritiska arborization i alla nervceller 8, kan DCX sättas in för att märka nyfödda nervceller särskilt i gyrus dentatus och subventrikulära zon 9, en viktig faktor med tanke på att neurogenes sker i både dessa regioner i hela livslängden 10,11.
Efter färgning, var två avbildningsmetoder användas för att bedöma dendritiska egenskaper: i) i realtid imaging (RTI) och ii) förlängdes skärpedjup imaging (EDFI). RTI-tekniken ger ett medelvärde för att spåra och kvantifiera längd och inbördes ordning arborization längs de enskilda dendritiska segmenten och grenar. Alltså det gör man för att uppskatta den totala ytan och volymen upptas av varje dendritiska träd. Fler specifically, i RTI-metoden användaren identifierar kontinuerligt de segment och refocuses iterativt som neuron spåra programvaran samlar x, y och z koordinater för dendritiska strukturen och rekonstruerar banan för dendritiska strukturen i 3D. Jämförelsevis ger EDFI metoden en ganska enkel och expedierade medel för att bedöma dendritiska täthet i ganska tjocka vävnadsprover genom att generera en sammansatt bild, som ger information om hela z-axeln. För att göra detta, registrerar användaren högupplösta videofiler genom hela tjockleken på sektionen och sedan använder programvara för att söka i bildrutor för att identifiera punkter där en pixel är helt i fokus. Därefter är de fokuserade pixlarna samman och integreras i en hög upplösning, komposit 2D-bild. Denna sammansatta bilden innehåller alla pixlar som var i fokus, oavsett deras position i z-axeln. Kvalitativ och kvantitativ analys av dessa 2D-bilder kan användas senare för att bestämma densitetenav dendritiska förgrening i varje fält.
Slutligen presenterar vi en panorama metod för att generera extremt högupplösta bilder för analys och bedömning av dendriter i en hel region av intresse. Denna teknik kan användas för att avhjälpa bristen på tillgång till mycket hög upplösning och dyra digitalkameror. Med denna metod, man fångar seriebilder på olika platser längs x- och y-axlarna och sedan automatiskt stygn ihop dem med ett gratisprogram (t.ex. Bild Composite Editor). Noterbart kan denna metod användas för kvalitativ och kvantitativ bedömning av dendritisk arborization i ett ganska stort område.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, var två metoder beskrivits för att kvantifiera omfattningen av dendritiska arborization i mogna och nyfödda nervceller med hjälp av konventionella färgningsmetoder i samband med RTI och EDFI. Erhållandet av högupplösta bilder av neuroner ger en extremt användbar metod för att testa de skadliga effekterna av neurodegenerativa störningar och, i sin tur, ger ett medel för att utvärdera terapeutiska strategier som riktar hippocampusneuroner.
Medan RTI-metoden användes för at…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Referências
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
