Оценка ветвления дендритов в зубчатой извилине гиппокампа области у мышей
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
Динамические изменения в количестве и структуре синапсов являются отличительными чертами развития, старения, а также многочисленные нейродегенеративные расстройства 1-3. Способность нейронов получать и интегрировать синаптической информации зависит от дендритных морфологии и динамических изменений в синаптических соединений. Действительно, положительная корреляция существует между дендритных позвоночника и количество синапсов, которые, как повлиять на когнитивные функции 4. Таким образом, нет ничего удивительного в том, что уменьшается на единицу в дендритной числа позвоночника были связаны с когнитивной дисфункции в ряде неврологических расстройств 5-7, побуждая большой интерес к дендритной количественного позвоночника. Тем не менее, количественное определение плотности позвоночника остается много времени и утомительной задачей, которая не генерирует полезную информацию о топографии и распределения синапсов через дендритной дерева. К счастью, методы окраски (например, Гольджи-Кокса и Даблкортин (DCX)) в сочетаниисо сложными методами визуализации может быть использован для преодоления существующих барьеров и создания изображений с высоким разрешением ветвления дендритов в надежной и оперативным образом. В то время как метод окрашивания Гольджи-Кокса могут быть развернуты для оценки состояния ветвления дендритов во всех нейронов 8, DCX могут быть развернуты для обозначения новорожденных нейронов, особенно в зубчатой извилине и субвентрикулярной зоне 9, важный фактор, учитывая, что нейрогенез происходит в обоих эти регионы на протяжении всей жизни 10,11.
После окрашивания два метода визуализации были развернуты для оценки дендритных характеристики: я) в реальном времени томография (РТИ) и б) Увеличение глубины резкости изображений (EDFI). Техника RTI обеспечивает среднее проследить и количественно длину и порядок разветвление вдоль отдельных дендритных сегментов и отраслей. Таким образом, она позволяет оценить общую площадь и объем, занимаемый каждым дереве дендритов. Ещё Specifically, в способе РТИ пользователь постоянно определяет сегменты и перефокусирует многократно, как нейрон отслеживания программного обеспечения собирает X, Y, и Z координаты дендритной структуры и восстанавливает траекторию дендритной структуры в 3D. Для сравнения, метод EDFI обеспечивает достаточно простые и быстрые средства для оценки дендритных плотность в образцах довольно толстых тканей путем создания составного изображения, обеспечивая информацию о всей оси. Чтобы сделать это, пользователь записывает видео высокой четкости файлы по всей толщине секции, а затем использует программное обеспечение для поиска видеокадров для идентификации точки, в котором пиксель полностью в фокусе. Впоследствии, ориентированные пикселы объединяются и интегрируются в высоком разрешении, композитный 2D изображения. Это составное изображение содержит все пиксели, которые были в фокусе независимо от их положения на оси Z. Качественный и количественный анализ этих 2D-изображений может быть использован в дальнейшем для определения плотностидендритных ветвлений в каждой области.
Наконец, мы представляем панорамный метод для генерации чрезвычайно высоким разрешением изображения для анализа и оценки дендритов в целой области интереса. Этот метод может быть развернута, чтобы преодолеть отсутствие доступа к очень высоким разрешением и дорогих цифровых камер. Используя этот метод, один захватывает последовательные изображения в различных местах вдоль х и у топоров, а затем автоматически сшивает их вместе, используя бесплатное программное обеспечение (например, изображения Композитный редактор). Следует отметить, что этот метод может быть использован для качественного и количественного определения ветвления дендритов в довольно большой площади.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вот два способа были описаны количественно степень ветвления дендритов в зрелых и новорожденных нейронов с помощью обычных методов окрашивания в сочетании с РТИ и EDFI. Получение изображений высокого разрешения нейронов обеспечивает чрезвычайно полезный метод для проверки вредное во?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Referências
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
