הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
שינויים דינמיים במספר ובמבנה של סינפסות הם מסימני היכר של פיתוח, הזדקנות, והפרעות ניווניות רבות 1-3. היכולת של נוירונים לקבל ולשלב מידע הסינפטי תלויה מורפולוגיה הדנדריטים ושינויים דינמיים בקשרים סינפטיים. ואכן, נמצא מתאם חיובי בין עמוד השדרה הדנדריטים ומספר סינפסה, ששניהם משפיעים על תפקוד הקוגניטיבי 4. לפיכך, אין זה מפתיע שdecrements במספר עמוד השדרה דנדריטים נקשר עם תפקוד קוגניטיבי לקוי במספר הפרעות נוירולוגיות 5-7, מה שגרם עניין רב בכימות עמוד השדרה הדנדריטים. אף על פי כן, כימות של צפיפות עמוד השדרה נשארה זמן רב ומשימה מייגעת שלא מצליח לייצר מידע שימושי בנוגע לטופוגרפיה וההפצה של סינפסות על פני העץ הדנדריטי. למרבה המזל, בשיטות צביעה (למשל, Golgi-קוקס וdoublecortin (DCX)) בשיתוףבעזרת שיטות הדמיה מתוחכמות יכול להיות מנוצל כדי להתגבר על מחסומים הנוכחיים ולהפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של arborization הדנדריטים באופן אמין ומהיר. בעוד ששיטת צביעת Golgi-קוקס ניתן לפרוס על מנת להעריך את המצב של arborization הדנדריטים בכל הנוירונים 8, ניתן לפרוס DCX לתייג נוירונים שזה עתה נולד במיוחד ברכס המשונן ואזור subventricular 9, שיקול חשוב בהתחשב בכך שneurogenesis מתרחשת בשני אזורים אלה בתוחלת החיים 10,11.
בעקבות צביעה, שתי שיטות הדמיה נפרסו להעריך מאפיינים דנדריטים: i) הדמיה בזמן אמת (RTI) ו- II) עומק מורחב של הדמיה שדה (EDFI). טכניקת RTI מספקת בממוצע לאתר ולכמת את האורך וסדר arborization לאורך המקטעים דנדריטים הפרט וסניפים. כך שהוא מאפשר לאמוד את השטח ונפח שנכבש על ידי כל עץ הדנדריטי הכולל. עוד specifically, בשיטת RTI המשתמש ברציפות מזהה את הקטעים והפניה מחודש איטרטיבי כנוירון התחקות תוכנה אוסף את x, y, z וקואורדינטות של המבנה הדנדריטי ומשחזר את מסלולו של המבנה הדנדריטי ב3D. יחסית, שיטת EDFI מספקת אמצעי פשוט למדי ומזורז להערכת צפיפות דנדריטים בדגימות רקמה עבות למדי על ידי יצירת תמונה מורכבת, מתן מידע על Z- הציר כולו. לשם כך, המשתמש רשומות קבצי וידאו בחדות גבוה בכל העובי של הסעיף ולאחר מכן משתמש בתוכנה כדי לחפש מסגרות וידאו לזהות נקודות בי פיקסל הוא לגמרי בפוקוס. בהמשך לכך, פיקסלים ממוקדים מתמזגים ומשתלבים ברזולוציה גבוהה, תמונת 2D מורכבת. תמונה מורכבת זה מכילה את כל הפיקסלים שהיו בפוקוס, ללא קשר למיקום שלהם בציר z. ניתוח איכותי וכמותי של תמונות 2D אלה יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את הצפיפותשל הדנדריטים הסתעפות בכל תחום.
לבסוף, אנו מציגים שיטת פנורמי ליצירת מאוד תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוח וההערכה של דנדריטים באזור כולו של עניין. טכניקה זו ניתן לפרוס כדי להתגבר על חוסר הנגישות לרזולוציה גבוהה מאוד ומצלמות דיגיטליות יקרות. באמצעות שיטה זו, אחד לוכד תמונות סידורי במקומות שונים לאורך הקואורדינטות x ו- y צירים ולאחר מכן באופן אוטומטי תפרים אותם יחד באמצעות תוכנה חופשית (למשל, תמונה מורכבת עורך). יש לציין, שיטה זו יכולה לשמש להערכה איכותית וכמותית של arborization הדנדריטים באזור רחב למדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, שתי שיטות שתוארו לכמת את היקף arborization הדנדריטים בתאים בוגרים וזה עתה נולד בשיטות צביעה קונבנציונליות בשיתוף עם RTI וEDFI. הרכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי עצב מספקת שיטה מאוד שימושית לבדיקת ההשפעות המזיקות של הפרעות ניווניות ו, בתורו, מספקת אמצעי להערכת אסטרט…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Referências
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
