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Neurociência

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Published: January 10, 2015
doi:
10.3791/52358
, ,
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2),Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA,RWTH Aachen University

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

La combinazione di permutazione registrazioni clamp da due (o più) neuroni sinapticamente accoppiati (registrazioni appaiati) in fettine cerebrali acute con simultanea riempimento biocitina intracellulare consente un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Con questo metodo è possibile identificare e caratterizzare sia neuroni postsinaptici pre e dalla loro morfologia e modello di risposta elettrofisiologica. Registrazioni accoppiati consentono studiare gli schemi di connettività tra questi neuroni e le proprietà di entrambi trasmissione sinaptica chimica ed elettrica. Qui diamo una descrizione step-by-step le procedure necessarie per ottenere registrazioni affidabili abbinati insieme ad un recupero ottimale della morfologia neurone. Descriveremo come coppie di neuroni collegati tramite sinapsi chimici o giunzioni sono identificati nei preparati fetta cervello. Vi illustrerà come i neuroni vengono ricostruiti per ottenere la loro morfologia 3D del Dendritic e dominio assonale e come contatti sinaptici sono identificati e localizzati. Discuteremo anche le avvertenze e le limitazioni della tecnica di registrazione associato, in particolare quelli associati con troncamenti dendritiche e assonale durante la preparazione di fettine di cervello, perché questi influenzano fortemente le stime di connettività. Tuttavia, a causa della versatilità dell'approccio di registrazione accoppiato rimarrà uno strumento prezioso nel caratterizzare diversi aspetti della trasmissione sinaptica a microcircuiti neuronali identificati nel cervello.

Introduction

Microcircuiti neuronali tra due neuroni sinapticamente accoppiati sono gli elementi costitutivi di reti su larga scala nel cervello e sono le unità fondamentali di elaborazione delle informazioni sinaptica. Un prerequisito per la caratterizzazione di tali microcircuiti neuronali è conoscere la morfologia e le proprietà funzionali di entrambi i neuroni Partner di pre-e post-sinaptici, il tipo di connessione sinaptica (s) e la sua struttura e meccanismo funzionale. Tuttavia, in molti studi di connessioni sinaptiche almeno uno dei neuroni in un microcircuito non è ben caratterizzata. Ciò risulta dai protocolli di stimolazione relativamente non specifici, spesso utilizzate in studi di connettività sinaptica. Pertanto, le proprietà strutturali e funzionali del neurone presinaptico sono o non identificati affatto o solo in misura piuttosto piccola (cioè, l'espressione di proteine ​​marker ecc). Registrazioni appaiati in combinazione con colorazione intracellulare mediante marcatori such come biocitina, neurobiotin o coloranti fluorescenti sono più adatti per lo studio di piccoli microcircuiti neurali. Questa tecnica permette di indagare molti parametri strutturali e funzionali di una connessione sinaptica morfologicamente identificato allo stesso tempo.

I cosiddetti «unitario» connessioni monosinaptici tra due neuroni sono stati studiati in entrambe le regioni cerebrali corticali e subcorticali 1-10 su preparazioni fetta acuta. Inizialmente, microelettrodi taglienti sono stati utilizzati in questi esperimenti; successivamente, la registrazione patch clamp è stato impiegato per ottenere registrazioni di segnali sinaptici con un livello di rumore inferiore ed una risoluzione temporale migliorata.

Un importante progresso tecnico è stato l'uso di contrasto interferenziale infrarossi (IR-DIC) ottiche 11-14, una tecnica microscopica che ha migliorato notevolmente la visibilità e l'identificazione dei neuroni nella fetta cervello in modo che è diventato possibile to ottenere registrazioni individuate visivamente connessioni sinaptiche 15-17. In generale, le registrazioni coppie sono fatte in fettine acute; solo pochissime pubblicazioni sono disponibili registrazioni segnalazione di neuroni sinapticamente collegati in vivo 18-20.

Il vantaggio più importante di registrazioni accoppiati è il fatto che una caratterizzazione funzionale può essere combinato con una analisi morfologica sia la luce e elettroni livello microscopico (vedi ad es., 7,16,21). Dopo l'elaborazione istochimico, la morfologia dendritica e assonale della coppia neurone sinapticamente collegato è tracciata. Successivamente, è possibile quantificare caratteristiche morfologiche quali lunghezza, densità spaziale, orientamento, ramificazione ecc Questi parametri possono quindi fornire una base per una classificazione obiettivo di una connessione sinaptica specifica. Inoltre, contrariamente alla maggior parte altre tecniche utilizzate per lo studio connecti neuronaliVity, abbinato registrazioni consentono anche l'individuazione dei contatti sinaptici per connessioni sinaptiche unitari. Questo può essere fatto direttamente utilizzando una combinazione di luce e di microscopia elettronica 16,21-27 o utilizzando Imaging di calcio 28,29 di spine dendritiche. Tuttavia, con quest'ultimo approccio unico eccitatoria ma non connessioni inibitorie possono essere studiate in quanto richiede flusso di calcio attraverso i canali recettori postsinaptici.

Oltre ad un'analisi dettagliata della trasmissione sinaptica ad un microcircuito accoppiato registrazioni neuronali definite anche permettere lo studio di regole di plasticità sinaptica 30,31 o – in combinazione con l'applicazione agonista / antagonista – la modulazione della trasmissione sinaptica da neurotrasmettitori come acetilcolina 32 e adenosina 33.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la Direttiva UE per la protezione degli animali, del benessere degli animali legge tedesca (Tierschutzgesetz) e le linee guida della Federazione of European Laboratory Animal Science Association. 1. Set-up per Elettrofisiologia Prima di iniziare con la registrazione accoppiato, un elettrofisiologia set-up deve essere costruito. Una breve descrizione di come un tale set-up è montato è il seguen…

Representative Results

Registrazioni associati sono il metodo di scelta per una caratterizzazione approfondita delle connessioni sinaptiche uniformi o bidirezionali morfologicamente identificati così come giunzione gap collegamenti (elettrici) (Figura 1). Un esempio di una registrazione accoppiato in strato 4 della corteccia somatosensoriale barilotto è mostrato nella Figura 1A. Sia eccitatorio unidirezionale e connessioni sinaptiche inibitorie possono essere caratterizzati (Figura 1B, C). …

Discussion

Registrazioni accoppiati da eccitatorio sinapticamente accoppiati e / o neuroni inibitori sono un approccio molto versatile per lo studio dei microcircuiti neuronali. Non solo questo approccio permette di stimare la connettività sinaptica tra tipi di neuroni, ma permette anche la determinazione delle caratteristiche funzionali della connessione e la morfologia dei neuroni pre- e postsinaptici. Inoltre, agonisti e / o antagonisti possono essere facilmente applicati ai neuroni in fettine. Questo permette di studiare gli …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2-3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares
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Paired Patch-clamp RecordingAcute Brain SliceNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionElectrophysiologyMorphologyConnectivityChemical SynapsesGap JunctionsNeuron ReconstructionDendritic TruncationAxonal Truncation

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Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).
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