網膜タックと2部網膜上インプラント：ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植した処理の目のための技術
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
網膜色素変性症（RP）は、神経活動に、光子の形態では、光伝達を担う網膜の最外層中の細胞である光受容体の広範な喪失を引き起こす遺伝性疾患である。重要なことは、RPの患者は、一般的にはまだ機能している彼らの網膜の他の層の残留ニューロンを持っている。網膜補綴は、視経路1,2を活性化するために電気刺激をこれらの生き残ったニューロンを標的とすることによって、これらの患者にいくつかの制限された視力を回復することが可能である。臨床試験の知覚の結果は初期の結果を約束して示されており、最近になって一部のデバイスは、商業的使用のために承認されている。 epiretinally 3,4、網膜下に5,6とsuprachoroidally 7,8：現在、臨床網膜補綴物が配置されている中で、3つの主要な解剖学的位置があります。異なるデバイスは、異なる材料を利用し、そのフォームがカスタマイズされています彼らが移植されている場所へ。しかし、それらはすべて、電気パルスで網膜の残留ニューロンを活性化することによって、視覚的な知覚を作成します。
初期配置または後続の継続的な力の機械的効果に起因する周囲の組織損傷への医療用補綴物のための可能性がある。網膜補綴移植可能な刺激器の場合には、電気的パラメータが安全な範囲内であるべきである追加の考慮事項がある。デバイスは、厳密に臨床設定9-15に進む前に、前臨床試験で試験されなければならないので、患者の安全性は、最も重要である。私たちのコンパニオンの記事では、脈絡膜上腔16内に配置インプラント周囲の目のローカライズされた組織病 理を評価するための方法を説明した。本論文では、我々は、前臨床（feの中で、epiretinally網膜にタック電極アレイの周囲の眼組織を視覚化するための技術を説明ライン）モデル（ 図1）。
網膜上の位置は、視覚的な人工器官の位置を特定するための最も一般的に利用される位置である。ここに位置する電極アレイは、一般的に、目17-20のすべての層を貫通する金属タックと網膜に固定されている。本論文に記載された技術の前に、正確にすぐにタックを取り囲む網膜および他の組織を評価することは困難であった。中性緩衝ホルマリンを使用して、標準的な眼の固定は、タックの固定点に対する網膜と強膜の差動移動による人為網膜損傷が生じた。したがってタックと網膜上の配列によって生じた実際の損害を正確に観察することができませんでした。金属物が容易に伝統的な組織学的装置で切断することができないように加えて、眼組織を区画すると、 その場での網膜のタックを用いて行うことができませんでした。組織学的処理の前にタックを除去することでもあったこれはまた、人為的な網膜損傷につながったとして望ましくない。
本研究の目的は二重であった：タック及び網膜上インプラントアレイによる損傷を確実に評価することができるように、1）網膜剥離アーチファクトを削減する。 2）それを除去せずにタックに隣接する網膜のアーキテクチャを可視化した。人為的な網膜剥離を減少させる、（関連記事16に記載されているように）目的1を達成するために、新たな固定技術を利用した。目的2を達成するために、我々は本来人工内耳電極21〜23 のその場観察にために開発され、研削、および研磨技術、埋め込 みを修正した。人工網膜の損傷を最小限にし、したがって、タックと網膜上の配列によって生じる潜在的な被害の正確な評価を可能にしながら、この原稿に記載された方法は、その場でタックへの周囲の網膜の視覚化と隣接することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
標準的な組織学的技術は、金属、ガラス、さらにはダイヤモンドブレードでこれらのオブジェクトを切削制限によるその場で硬い金属インプラントを処理することができません。我々の仲間紙16には、修正された全眼固定技術の使用は、人為的な網膜剥離を減少させることができることを示した。現在の原稿では、 その場で人工内耳の21-23を可視化するための確立された研削·研磨技術は、網膜人工器官用に変更した。網膜に電極アレイを固定するために使用されるチタンタックは、epiretinally、周囲の眼組織と共にエポキシに包埋した。この樹脂ブロックは、次に、適切に配向され、次第に地面/金属タックにすぐ隣接する組織形態を明らかにするために研磨した。様々な深さでのブロックの研磨面の画像は、強力な解剖顕微鏡で撮影した。可視化とつの評価：このテクニックはするのに便利です網膜上インプラントに隣接する組織応答をる。移植片の移植に関連した外科的外傷を評価する。硬質の金属成分に対する生物学的反応を決定する。インプラントと網膜表面との間の距離を測定する。
この技術は、眼における網膜タックまたは他の硬質（ 例えば、金属製）のオブジェクトに隣接する領域のインサイチュ可視化のための将来の安全性試験に有用であろう。これはepiretinally網膜にタックプロテーゼの前臨床安全性を評価する直接的な適用を有する。また、網膜下の場所に位置してインプラントと接触している網膜の領域における組織の損傷を評価するために有用であり得る。
技術が正しく行われたことを確認するためにいくつかの方法がある。各段階で、網膜は、眼の外側の層に付着したまま必要があります。総人工網膜剥離がある場合、これはインド語あり固定に問題があることを食べた。サンプルが埋め込まれ、最終的な樹脂中に再配向される場合には網膜がブロックの研削面と直交に近くなるはずブロックする。これは、斜めのカットを最小限に抑えることができます。これは、（例えば網膜タックなど）オブジェクトを横断するのに必要な（既知のステップサイズの）増分研削ステップの数は、オブジェクトの寸法に応じて相関していることを確認することが有用である。
技術は、いくつかの方法で最適化することができる。研削プロセスに関連付けられたエポキシブロックの表面に傷が次第に細かいグレードの研磨を低減することができる。本研究のために、我々は、800 1000、1200、2400、4000グレードのシリコンカーバイド紙を使用した。ダイヤモンドペーストは、表面仕上げを改善するために使用することができる。微細な表面仕上げを高品質な画像が得られるが、追加の研磨時間を犠牲に。この技術の成果を改善するための別の重要な検討事項は、OPTIの選択と品質ですcsの、照明、画像キャプチャのために使用した。他の基本的な組織学的染色 – 特にニッスル染色は、トルイジンブルーの代わりに使用することができるが、さらなる最適化を必要とする場合がある。シミは、樹脂だけでなく、組織（ 例えば 、エオシン）、したがって、浅いポリッシュが背景変色を除去するための染色後に必要になることがありますを染色する。専門汚れ、蛍光色素および免疫組織化学的染色は行われませんでしたが、非常に特定の結果が望まれない限り、各研削レベルでこれらの汚れを実行するためにかなりの時間が必要である可能性が高い。しかし、埋め込 みステップ（ステップ3.4）24の前に、全体として組織を染色することが可能である。
この技術の主な制限は、したがって、それは、研削、研磨の各段階での倍率の多様で多くの（おそらく冗長）の画像をキャプチャすることが賢明である、関心領域が離れて粉砕された後、それを取得することができないことである。それはあるまた、それぞれの研削深さ調整のために小さな増分を使用することが重要。この技術の他の制限は、組織をスライドガラス上にマウントし、標準（透過）光学顕微鏡で観察と比較して光学倍率および解像度のものである。プロトタイピングおよび新規なインプラント装置の安全性を評価する目的のために、肉眼的病理評価が主要な関心である。この技術は、網膜のタックに関連付けられ、臨床的に関連する損傷を観察するための効率的な方法を提供する。練習では、グラインドを収集するために必要な時間は、与えられた試料（一度埋め込まれた）ポリッシュと写真、それはセクションにパラフィンブロックまたは凍結切片を取ると時間に匹敵する。
網膜インプラントの範囲外の用途に拡張することが、本技術の可能性もあります。この技術は、インプラント抽出feasibないハード·インプラントに隣接する組織を評価するのに適しているルまたはインタフェースを損傷する。例えば、この技術は、いくつかの深部脳または末梢神経電極、薬物送達のためのカニューレ、血管ステントのような従来の組織学的技術を用いて切断することができない金属（ 例えば 、白金、ニチノールなど ）から作られたインプラントを評価するために拡張することができるまたは整形外科人工器官。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
Referências
- Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
- Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
- Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
- Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
- Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
- Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
- Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182 (2014).
- Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).
- Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe’s Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
- Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
- Seo, J. -. M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
- Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
- Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).
- Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
- Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).
