TIRFM och pH-känsliga GFP-sonder för att utvärdera Neurotransmitter Vesikel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastomceller: cell imaging och dataanalys

Kemisk synaptisk transmission mellan nervceller är en viktig mekanism för kommunikation i nervsystemet. Det bygger på frisättningen av neurotransmittorer genom en dynamisk cykel av vesikelfusion och hämtning vid presynaptiska platsen. Många av de proteiner involverade i vesikler dynamik har identifierats; dock fortfarande deras specifika bidrag till fenomenet förtydligas ^1.

Vår förståelse är delvis begränsad av det faktum att de mest använda analyser för exo / endocytos är inte alltid den mest lämpliga. Flera studier relaterade till vesikelfusion och dynamik beroende elektrofysiologiska tekniker. Denna teknik ger en optimal tidsupplösning och är utmärkt för att undersöka den inledande fusion av vesiklar till plasmamembranet, men är oförmögen att upptäcka många av de bakomliggande molekylära händelser som stödjer presynaptiska funktion. Elektronmikroskopi, på andra sidan, tillhandahåller den finaste morphological beskrivning av varje singular steg, men den dynamiska aspekten av händelsen kan inte fångas, eftersom proverna måste fastställas för att analyseras.

Tillkomsten av nya optiska inspelningsteknik ^2,3, i kombination med framsteg inom fluorescerande molekylära sonder utveckling ^4-6, möjliggör visualisering av exocytiska processer i levande celler, vilket ger nya nivåer av information om synaptiska struktur och funktion.

Initiala studier utnyttjade aktivitetsberoende styrylfärgämnen (FM1-43 och tillhörande organiska färgämnen) ^7,8. State-of-the-art avbildningstekniker använder pH-känsliga varianter av grönt fluorescerande protein (GFP) (pHluorin) bundna till luminala blåsor proteiner ^9. Dessa prober är vanligen avstängd när de är närvarande i vesiklarna grund av den låga luminala pH. Efter fusion med plasmamembranet, är vesikeln inre exponeras för den neutrala extracellulära utrymmet, pH plötsligt ökar, lindrar protonberoende dämpning av pHluorin och den fluorescerande signalen visas snabbt. Eftersom denna ändring av pHluorin är snabbare än fusions händelse, genom att övervaka fluorescensökningar, kan vesikelfusion med membranet mätas och analyseras. Eftersom ytan pHluorin-märkta molekyler endocyteras, fluorescenssignalen återgår därefter till basal nivå, alltså samma konstruktion kan också användas för att övervaka vesikler återvinning ^9.

Medan blås taggade pH-sensor säkerställer visualisering endast de blåsor som verkligen smälter med plasmamembranet, är avbildning vid hög rumslig och tidsmässig upplösning som krävs för att beskriva i detalj de steg som ingår i exo / endocytiska processer. Den optiska teknik som ger den nödvändiga spatio-temporal upplösning är total intern reflektion fluorescens mikroskopi (TIRFM), en tillämpning av fluorescensmikroskopi ^10.

"> Total intern reflektion sker vid gränsytan mellan glaskupa-slip och provet. När ljusstrålen når skyddsglaset-slip med en infallsvinkel större än den kritiska vinkeln, är excitationsljuset överförs inte i provet, men är helt reflekteras tillbaka. Under dessa betingelser, en evanescent ljus vågformer vid gränsytan och fortplantas i mediet med mindre optisk densitet (provet). Eftersom intensiteten hos det evanescenta fältet avtar exponentiellt med avståndet från gränsytan (med ett penetrationsdjup av ca 100 nm) endast fluoroforema i närmaste närhet till cover-slip kan exciteras medan de längre bort från gränsen inte. I celler transfekterade med GFP-konstruktioner, motsvarar detta djup till proteiner som uttrycks på plasmamembranet eller vesikulära strukturer närmar det. Som fluoroforer i cellens inre inte kan exciteras, är bakgrunden fluorescens minimeras, och en bild med en mycket hög signal / bakgrund råttaio bildas ^11.

Flera egenskaper gör TIRFM tekniken i valet för att övervaka blåsor dynamik. Den perfekta kontrast och hög signal-till-brus-förhållande medge detektering av mycket låga signaler som härrör från enstaka vesiklar. Chip-baserad bild förvärv i varje bildruta ger den tidsupplösning som krävs för att upptäcka mycket dynamiska processer. Slutligen minimal exponering av celler för ljus på någon annan planet i provet minskar starkt fototoxicitet och möjliggör långvarig inspelning med tidsluckor ^12.

Dataanalys är fortfarande den mest utmanande och avgörande aspekt av denna teknik. Det enklaste sättet att övervaka vesikelfusion är att mäta ackumuleringen av reporter fluorescerande proteiner vid cellytan, över tiden ^13. Som fusions ökar, netto fluorescens signalen ökar liksom. Emellertid kan denna metod underskatta processen, särskilt i stora celler och när man vilar,eftersom endocytos och Fotoblekning processer kompensera ökningen i fluorescensintensiteten på grund av vesikler exocytos. En alternativ metod är att följa varje enskild fusions event ^14. Den senare metoden är mycket känslig och kan avslöja viktiga detaljer om fusionsmekanismer. Det kräver dock att manuellt val av enstaka händelser, eftersom helt automatiserade rutiner för att följa blåsor och registrera fluktuationer i deras fluorescerande signaler är inte alltid tillgängliga. Observation av vesikler dynamiken kräver provtagningsceller med hög frekvens. Detta genererar en stor mängd data som knappast kan analyseras manuellt.

Förslaget med denna uppsats är att optimera TIRFM avbildningsteknik för övervakning av basal och stimulerad frisättning av signalsubstans i SH-5YSY neuroblastomcellinjen, och beskriva, steg-för-steg, ett förfarande som utarbetats i laboratoriet för att analysera data, både på hel-cell och singel-vesikler nivåer.