TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

La transmisión sináptica química entre las neuronas es un mecanismo principal de la comunicación en el sistema nervioso. Se basa en la liberación de neurotransmisores a través de un ciclo dinámico de la fusión de vesículas y la recuperación en el sitio presináptica. Muchas de las proteínas implicadas en la dinámica de vesículas han sido identificados; Sin embargo, su contribución específica al fenómeno queda por aclarar ^1.

Nuestro entendimiento está parcialmente limitada por el hecho de que los ensayos más utilizados para exo / endocitosis no siempre son las más adecuadas. Varios estudios relacionados con la fusión de vesículas y la dinámica se basan en técnicas electrofisiológicas. Esta técnica proporciona una resolución temporal óptimo y es excelente para la investigación de la fusión inicial de vesículas a la membrana plasmática, pero es incapaz de detectar muchos de los eventos moleculares subyacentes que apoyan la función presináptica. La microscopía electrónica, en el otro lado, ofrece la mejor morphological descripción de cada paso singular, pero el aspecto dinámico del evento no puede ser capturado, ya que las muestras deben ser fijados con el fin de ser analizados.

El advenimiento de nuevas técnicas de grabación óptica ^{de 2,3,} en combinación con los avances en el desarrollo de sondas moleculares fluorescentes ^4-6, permite la visualización de los procesos de exocytic pt células vivas, proporcionando así nuevos niveles de información sobre la estructura y la función sináptica.

Los estudios iniciales explotadas tintes dependientes de la actividad de estirilo (FM1-43 y tintes orgánicos relacionados) ^7,8. Estado-of-the-art técnicas de imagen emplean variantes sensibles al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) atado a proteínas vesículas luminales ^9. Estas sondas están normalmente desconectados cuando está presente en las vesículas debido al bajo pH luminal. Después de la fusión con la membrana plasmática, el interior de vesículas se expone al espacio extracelular neutral, el pH aumenta abruptamente, alivia la extinción de protones dependiente de pHluorin y la señal fluorescente aparece rápidamente. Como el cambio en pHluorin es más rápido que el evento de fusión, mediante el control de los incrementos de fluorescencia, la fusión de vesículas con la membrana se puede medir y analizar. Debido a que las moléculas de pHluorin-etiquetado de superficie se endocitosis, la señal de fluorescencia posteriormente vuelve al nivel basal, por lo tanto, la misma construcción puede utilizarse también para controlar la vesícula reciclaje ^9.

Mientras que el sensor de pH de vesículas etiquetado asegura la visualización solamente de las vesículas que realmente se fusionan con la membrana plasmática, se requiere formación de imágenes en alta resolución espacial y temporal para describir en detalle los pasos implicados en los procesos de endocitosis exo /. La técnica óptica que proporciona la resolución espacio-temporal es necesario microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM), una aplicación de la microscopía de fluorescencia ^10.

"> La reflexión interna total se produce en la interfase entre el cubre de vidrio y la muestra. Cuando la trayectoria de la luz alcanza el cubre de vidrio con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, la luz de excitación no se transmite en la muestra, pero es completamente reflejada de nuevo. En estas condiciones, un evanescentes formas de onda de la luz en la interfase y se propaga en el medio con menos densidad óptica (la muestra). Como la intensidad del campo evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz (con una profundidad de penetración de alrededor de 100 nm) sólo los fluoróforos en la proximidad más cercana a la hoja de la cubierta puede ser excitado mientras que aquellos más lejos de la frontera no lo son. En las células transfectadas con GFP-construcciones, esta profundidad corresponde a las proteínas expresadas en la membrana plasmática o en estructuras vesiculares acercarse a ella. Como fluoróforos en el interior de la célula no pueden ser excitados, la fluorescencia de fondo se reduce al mínimo, y una imagen con una señal de muy alta / fondo de rataio se forma ^11.

Varias características hacen TIRFM la técnica de elección para el seguimiento de la dinámica de las vesículas. El contraste perfecto y la relación señal a ruido más alta relación de permiten la detección de señales muy bajas derivadas de vesículas individuales. Adquisición de imágenes basado en un chip en cada cuadro proporciona la resolución temporal necesaria para detectar procesos altamente dinámicos. Por último, la mínima exposición de las células a la luz en cualquier otro plano de la muestra reduce fuertemente la fototoxicidad y permite la grabación de largo lapso de tiempo duradero ^12.

Análisis de los datos sigue siendo el aspecto más difícil y crucial de esta técnica. La manera más simple para monitorizar la fusión de vesículas es medir la acumulación de proteínas fluorescentes reportero en la superficie celular, con el tiempo ^13. A medida que aumenta la fusión, neto aumenta señal de fluorescencia así. Sin embargo, este método puede subestimar el proceso, sobre todo en las células grandes y en condiciones de reposo,porque los procesos de endocitosis y fotoblanqueo compensar el aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la exocitosis de vesículas. Un método alternativo es seguir cada evento de fusión única ^14. Este último método es muy sensible y puede revelar detalles importantes sobre los mecanismos de fusión. Sin embargo, requiere la selección manual de los eventos individuales, porque los procedimientos completamente automatizados para seguir vesículas y registrar la fluctuación de sus señales fluorescentes no siempre están disponibles. Observación de la dinámica de vesículas requiere células de muestreo a alta frecuencia. Esto genera una gran cantidad de datos que difícilmente pueden ser analizados manualmente.

La propuesta de este trabajo es optimizar la técnica de imagen TIRFM para el seguimiento de la basal y estimulado la liberación de neurotransmisores en la línea celular de neuroblastoma SH-5YSY, y describir, paso a paso, un procedimiento desarrollado en el laboratorio para analizar los datos, tanto en los niveles de células enteras y de una sola vesícula.