A transmissão sináptica química entre neurónios é um dos principais mecanismos de comunicação no sistema nervoso. Baseia-se na liberação de neurotransmissores através de um ciclo dinâmico de fusão das vesículas e recuperação no local da pré-sináptico. Muitas das proteínas envolvidas na dinâmica das vesículas foram identificados; no entanto, sua contribuição específica para o fenômeno ainda precisa ser esclarecido ^1.

A nossa compreensão é parcialmente limitada pelo facto de que os ensaios mais amplamente utilizados para a exo / endocitose nem sempre são as mais adequadas. Vários estudos relacionados com a fusão das vesículas e dinâmicas dependem de técnicas eletrofisiológicas. Esta técnica fornece uma melhor resolução temporal e é excelente para investigar a fusão inicial de vesículas para a membrana do plasma, mas é incapaz de detectar muitos dos eventos moleculares subjacentes que suportem a função de pré-sináptico. A microscopia electrónica, por outro lado, proporciona os melhores morphological descrição de cada passo singular, mas o aspecto dinâmico do acontecimento não pode ser capturado, como as amostras devem ser fixados a fim de ser analisado.

O advento de novas técnicas de gravação óptica ^2,3, em combinação com os avanços na fluorescente sondas moleculares desenvolvimento ^4-6, permite a visualização de processos exocíticas em células vivas, proporcionando novos níveis de informações sobre a estrutura e função sináptica.

Estudos iniciais exploradas corantes dependentes de atividade estirilo (FM1-43 e corantes orgânicos relacionados) ^7,8. State-of-the-art técnicas de imagem empregar variantes da proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) amarrado a vesículas proteínas luminais ⁹ sensíveis ao pH. Estas sondas são normalmente desligado quando presente nas vesículas devido ao baixo pH luminal. Após a fusão com a membrana plasmática, o interior das vesículas está exposta ao espaço extracelular neutro, o pH abruptamente aumenta, alivia a extinção dependente de protões de pHluorin e o sinal fluorescente rapidamente aparece. Como a mudança de pHluorin é mais rápido do que o evento de fusão, através da monitorização da fluorescência aumenta, a fusão das vesículas com a membrana podem ser medidos e analisados. Como as moléculas da superfície marcadas com pHluorin sofrem endocitose, o sinal de fluorescência, subsequentemente, regressa ao nível basal, por conseguinte, a mesma construção pode também ser utilizada para monitorar vesícula reciclagem ^9.

Enquanto o sensor de pH com etiquetas de vesículas assegura a visualização de somente aquelas vesículas que realmente fundem com a membrana plasmática, a imagem em alta resolução espacial e temporal, é necessário para descrever detalhadamente os passos envolvidos nos processos de endocitose exo /. A técnica óptica que proporciona a resolução espacial e temporal, é necessário microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), um pedido de microscopia de fluorescência ^10.

"> A reflexão interna total ocorre na interface entre a lamela de vidro e a amostra. Quando o percurso da luz atinge a lamela de vidro com um ângulo de incidência maior do que o ângulo crítico, a luz de excitação não é transmitido para a amostra, mas é completamente reflectido de volta. Nestas condições, forma-se uma na interface onda evanescente de luz e se propaga no meio com menor densidade óptica (a amostra). À medida que a intensidade do campo evanescente decai exponencialmente com a distância a partir da interface (com uma profundidade de penetração cerca de 100 nm) apenas os fluoróforos mais próximo em proximidade com a tampa-derrapante pode ser animado, enquanto os mais longe do limite não são. Em células transfectadas com construções de GFP, esta profundidade corresponde a proteínas expressas na membrana plasmática ou em estruturas vesiculares aproximando-se. Tal como fluoróforos no interior da célula não pode ser excitado, a fluorescência de fundo é minimizado, e uma imagem com um sinal muito alta / rato fundoio é formada ^11.

Várias características tornam TIRFM a técnica de escolha para o monitoramento vesículas dinâmica. O perfeito contraste e o sinal-para-ruído elevado rácio de permitir a detecção de sinais de muito baixo a partir das vesículas resultantes individuais. Aquisição de imagem baseada em chip em cada quadro fornece a resolução temporal necessário para detectar processos altamente dinâmicos. Por fim, a exposição mínima de células à luz a qualquer outro avião na amostra reduz fortemente fototoxicidade e permite a gravação de longo lapso de tempo com duração ^{de 12.}

A análise dos dados continua a ser o aspecto mais desafiador e crucial desta técnica. A maneira mais simples para controlar a fusão das vesículas é medir a acumulação de proteínas repórter fluorescente à superfície da célula, ao longo do tempo ^13. À medida que aumenta de fusão, líquidos aumenta de sinal de fluorescência bem. No entanto, este método pode subestimar o processo, particularmente em células grandes e em condições de repouso,porque os processos de endocitose e fotodegradação compensar o aumento na intensidade de fluorescência devido à vesícula exocitose. Um método alternativo é seguir cada evento único fusão ^14. Este último método é muito sensível e pode revelar detalhes importantes sobre os mecanismos de fusão. No entanto, ele requer a seleção manual de eventos únicos, porque os procedimentos completamente automatizados para seguir vesículas e registrar a flutuação de seus sinais fluorescentes nem sempre estão disponíveis. Observação da dinâmica das vesículas requer células de amostragem em alta freqüência. Isto gera uma grande quantidade de dados que não podem ser analisados ​​manualmente.

A proposta deste artigo é o de otimizar a técnica de imagem TIRFM para monitorar o basal e liberação de neurotransmissores estimulada na linha de células de neuroblastoma SH-5YSY, e descrever, passo-a-passo, um procedimento desenvolvido no laboratório de análise de dados, tanto em níveis de célula inteira e única de vesículas.