細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

ニューロン間の化学シナプス伝達は、神経系におけるコミュニケーションの主要なメカニズムである。それは、シナプス前サイトでの小胞融合と検索の動的なサイクルを通して神経伝達物質の放出に依存している。小胞動態に関与するタンパク質の多くが同定されている。しかし、現象への具体的な貢献は^、1を明確にされていない。

我々の理解は、部分的に、エキソ/エンドサイトーシスのために最も広く使用されるアッセイは、常に最も適切ではないという事実によって制限される。小胞融合とダイナミクスに関連したいくつかの研究では、電気生理学的手法に依存している。この技術は、最適な時間分解能を提供し、原形質膜への小胞の初期の融合を調査するための優れているが、シナプス前機能をサポートする基礎となる分子事象の多くを検出できない。電子顕微鏡は、他の側に、最高級のmorphologicaを提供していますサンプルが分析されるために修正される必要があるため、Lの各特異ステップの説明が、イベントの動的な側面は、捕獲することができない。

新たな光記録技術の出現^2,3は 、蛍光分子プローブの開発^4-6の進歩と組み合わせて、このようにシナプスの構造と機能についての情報の新しいレベルを提供する、 生きた細胞内のエキソサイトーシスのプロセスの可視化を可能にします。

初期の研究に活用活動依存スチリル染料（FM1-43および関連有機染料^）7,8。最先端のイメージング技術は、管腔小胞タンパク質⁹につなが緑色蛍光タンパク質（GFP）（pHluorin）のpH感受性変異体を使用する。これらのプローブは、通常は低いため管腔のpHをベシクル中に存在する場合にオフになります。原形質膜との融合の後、小胞の内部は中性細胞外空間のpHに曝露される突然、増加pHluorinのプロトン依存消光を軽減し、蛍光シグナルが急速に表示されます。 pHluorinの変化は、蛍光の増加を監視することにより、融合事象よりも高速であるように、膜との小胞の融合を測定し、分析することができる。表面pHluorinタグ化分子はエンドサイトーシスされているので、蛍光シグナルは、その後、基礎レベルに戻るので、同一の構築物は^、9のリサイクル小胞を監視するためにも使用することができる。

小胞 – タグ付きのpHセンサーはだけは本当に細胞膜と融合するもの胞の可視化を保証しながら、高い空間と時間分解能でのイメージングは​​細部にエキソ/エンドサイトーシスプロセスに関与する手順を記述するために必要とされる。必要な時空間分解能を提供する光学技術は、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）、蛍光顕微鏡¹⁰の適用である。

">内部全反射は、光路が臨界角よりも大きな入射角でガラスカバースリップに達するとガラスカバースリップと試料との間の界面で発生する励起光を試料に伝達されないが完全界面におけるエバネッセント光の波形は、これらの条件下ではバックの反射が少ない光学濃度（サンプル）を含む培地中で伝播する。エバネッセント場の強度の侵入深さで（界面からの距離とともに指数関数的に減衰するようにさらに、境界から離れたものがGFP構築物でトランスフェクトした細胞ではなくなってから約100nm）をカバースリップに最も近接のみフルオロフォアを励起することができ、この深さは、原形質膜上に発現されるタンパク質、または小胞構造に対応細胞内部でフルオロフォアを励起することができないように、バックグラウンド蛍光が最小化される。それに接近し、非常に高いシグナル/バックグラウンドラットの画像ioが^11が形成されている。

いくつかの特徴は、小胞の動態を監視するための選択肢のTIRFM技術を作る。完璧なコントラスト及び高い信号対雑音比は、単一の小胞に由来する非常に低い信号の検出を可能にする。各フレーム内のチップベースの画像取得が非常に動的なプロセスを検出するのに必要な時間分解能を提供する。最後に、サンプル内の他の面での光への細胞の最小限の露出が強く光毒性を軽減し、長期的なタイムラプス記録^12を可能に^します。

データ分析は、この技術の最も挑戦的で重要な側面のまま。小胞の融合をモニターするための最も簡単な方法は、時間¹³にわたって、細胞表面でのレポーター蛍光タンパク質の蓄積を測定することである。融合が増大すると、正味の蛍光シグナルも同様に増加する。しかし、この方法は、特に大細胞および休止状態で、プロセスを過小評価することが、エンドサイトーシスおよび光退色プロセスにより小胞のエキソサイトーシスに対する蛍光強度の増加を相殺するためである。別の方法は、各単一の融合事象^14に従うことである。この後者の方法は非常に敏感であり、融合のメカニズムに関する重要な詳細を明らかにすることができます。完全に自動化された手順は、小胞を追跡し、それらの蛍光シグナルの変動を登録するために常に利用可能ではないので、それは、単一のイベントを手動で選択する必要がある。小胞の動態を観察したところ、高い周波数でサンプリングセルが必要です。これは、ほとんど手動で分析することができない大量のデータを生成する。

この論文の提案は両方、基礎を監視するためのTIRFMイメージング技術を最適化し、SH-5YSY神経芽細胞腫細胞株における神経伝達物質の放出を刺激し、そしてデータを分析するために、ステップバイステップで、実験室で開発された手順を記述することである全細胞および単一小胞レベルで。