TIRFM और पीएच के प्रति संवेदनशील GFP-जांच एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं में neurotransmitter पुटिका गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए: सेल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण
Summary
This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
Abstract
Synaptic vesicles फ्यूजन और पुनः प्राप्ति के एक गतिशील चक्र के माध्यम से रासायनिक synapses पर न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज। वास्तविक समय में synaptic गतिविधि की निगरानी और एकल पुटिका स्तर पर EXO-endocytosis के विभिन्न चरणों विदारक स्वास्थ्य और रोग में synaptic कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
सीधे अन्तर्ग्रथनी vesicles और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के लिए लक्षित पीएच के प्रति संवेदनशील जांच पुटिका गतिशीलता का पालन करने के लिए आवश्यक spatio- लौकिक संकल्प प्रदान आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग। कुल आंतरिक प्रतिबिंब द्वारा उत्पन्न क्षणभंगुर क्षेत्र केवल EXO-endocytosis की प्रक्रियाओं जगह ले वास्तव में, जहां, कोशिकाओं का पालन करना है जिस पर गिलास को कवर के ऊपर एक पतली परत (<150 एनएम) में रखा fluorophores उत्तेजित कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप उच्च विपरीत छवियों आदर्श रूप से नज़र रखने vesicles और फ्यूजन की घटनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।
इस प्रोटोकॉल में, एसएच SY5Y मानव एनeuroblastoma कोशिकाओं क्योंकि उनके फ्लैट सतह की, TIRFM द्वारा एकल पुटिका स्तर पर neurotransmitter रिहाई के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल और छितरी हुई vesicles की उपस्थिति के रूप में प्रस्तावित कर रहे हैं। पक्षपाती कोशिकाओं के रूप में एसएच SY5Y उगाने के लिए और synapto-pHluorin के साथ उन्हें transfecting के लिए तरीकों TIRFM और इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए तकनीक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदान की जाती हैं। अंत में, का चयन करें, गिनती, और पूरे सेल और एकल पुटिका स्तरों पर संलयन की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य के लिए एक रणनीति प्रस्तुत किया है।
इमेजिंग प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए, pHluorin टैग पुटिकाओं की गतिशीलता विश्राम के तहत विश्लेषण कर रहे हैं और शर्तों (पोटेशियम सांद्रता depolarizing) को प्रेरित किया। झिल्ली विध्रुवण संलयन घटनाओं की आवृत्ति बढ़ जाती है और पूरे सेल में दर्ज की गई शुद्ध प्रतिदीप्ति संकेत के एक समानांतर उठाना कारण बनता है। एकल पुटिका विश्लेषण संलयन घटना व्यवहार (बढ़ा शिखर ऊंचाई और चौड़ाई) के संशोधनों का पता चलता है। इन आंकड़ों वें का सुझावपोटेशियम विध्रुवण पर एक विशाल neurotransmitter रिहाई लाती है लेकिन यह भी पुटिका संलयन और रीसाइक्लिंग के तंत्र को संशोधित करता ही नहीं है।
उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ, इस तकनीक का विधान और उत्तेजित स्राव के तंत्र काटना अलग सेलुलर प्रणाली में नियोजित किया जा सकता है।
Introduction
न्यूरॉन्स के बीच रासायनिक synaptic प्रसारण तंत्रिका तंत्र में संचार का एक प्रमुख तंत्र है। यह प्रीसानेप्टिक स्थल पर पुटिका संलयन और पुनः प्राप्ति के एक गतिशील चक्र के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई पर निर्भर करता है। पुटिका गतिशीलता में शामिल प्रोटीन में से कई की पहचान की गई है; हालांकि, घटना के लिए उनके विशिष्ट योगदान एक स्पष्ट किया जाना बना रहता है।
हमारी समझ आंशिक रूप से EXO / endocytosis के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया assays के हमेशा के लिए सबसे उपयुक्त नहीं हैं कि इस तथ्य से सीमित है। कई पुटिका संलयन से संबंधित अध्ययन और गतिशीलता electrophysiological तकनीक पर भरोसा करते हैं। इस तकनीक को एक इष्टतम अस्थायी समाधान प्रदान करता है और प्लाज्मा झिल्ली vesicles के प्रारंभिक संलयन की जांच के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन प्रीसानेप्टिक समारोह का समर्थन करने वाले अंतर्निहित आणविक घटनाओं से कई का पता लगाने में असमर्थ है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, दूसरी तरफ, बेहतरीन morphologica प्रदान करता हैनमूनों का विश्लेषण किया जा क्रम में तय किया जाना चाहिए क्योंकि प्रत्येक विलक्षण कदम है, लेकिन घटना के गतिशील पहलू के एल विवरण, कब्जा नहीं किया जा सकता है।
फ्लोरोसेंट आणविक जांच विकास 4-6 के क्षेत्र में प्रगति के साथ संयोजन में नई ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तकनीकों 2,3, के आगमन, इस प्रकार के synaptic संरचना और समारोह के बारे में जानकारी के लिए नए स्तर प्रदान करने, जीवित कोशिकाओं में exocytic प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है।
प्रारंभिक अध्ययन शोषण गतिविधि पर निर्भर styryl रंजक (FM1-43 और संबंधित कार्बनिक रंजक) 7,8। राज्य के अत्याधुनिक इमेजिंग तकनीक luminal पुटिकाओं प्रोटीन से 9 तक सीमित ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) (pHluorin) के पीएच के प्रति संवेदनशील वेरिएंट को रोजगार। ये जांच सामान्य रूप से, क्योंकि कम luminal पीएच की पुटिकाओं में जब वर्तमान बंद कर रहे हैं। प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूजन के बाद, पुटिका इंटीरियर तटस्थ बाह्य अंतरिक्ष, पीएच के संपर्क में है अचानक बढ़ जाती है, pHluorin का प्रोटॉन-निर्भर शमन से राहत मिलती है और फ्लोरोसेंट संकेत तेजी से प्रकट होता है। PHluorin में परिवर्तन प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है की निगरानी के द्वारा, फ्यूजन घटना की तुलना में तेजी है, झिल्ली के साथ पुटिका संलयन मापा और विश्लेषण किया जा सकता है। सतह pHluorin टैग अणुओं endocytosed कर रहे हैं, प्रतिदीप्ति संकेत बाद में इसलिए एक ही निर्माण पुटिका 9 रीसाइक्लिंग की निगरानी के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, बेसल स्तर के लिए आए।
पुटिका टैग पीएच-सेंसर ही वास्तव में प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज कि उन पुटिकाओं के दृश्य सुनिश्चित करता है, वहीं उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प इमेजिंग विवरण में EXO / endocytic प्रक्रियाओं में शामिल कदम का वर्णन करने के लिए आवश्यक है। आवश्यक spatio- लौकिक संकल्प प्रदान करता है कि ऑप्टिकल तकनीक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 10 के एक आवेदन पत्र है।
"> कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रकाश पथ महत्वपूर्ण कोण से भी बड़ा एक घटना कोण के साथ गिलास को कवर पर्ची तक पहुँच जाता है गिलास को कवर पर्ची और नमूना। के बीच इंटरफेस में होता है, उत्तेजना प्रकाश नमूना में फैलता है, लेकिन नहीं है पूरी तरह से वापस परिलक्षित होता है। इन स्थितियों, इंटरफेस में एक क्षणभंगुर प्रकाश लहर रूपों के तहत और क्षणभंगुर क्षेत्र की तीव्रता का एक प्रवेश गहराई के साथ (इंटरफ़ेस से दूरी के साथ तेजी से नाश होता जाता है। कम ऑप्टिकल घनत्व (नमूना) के साथ मध्यम में प्रसारित आगे दूर सीमा से उन GFP-निर्माणों साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में। नहीं कर रहे हैं, जबकि लगभग 100 एनएम) कवर पर्ची करने के लिए करीब निकटता में केवल fluorophores के लिए उत्साहित किया जा सकता है, इस गहराई प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीन करने के लिए या vesicular संरचनाओं में मेल खाती है सेल इंटीरियर में fluorophores उत्साहित नहीं किया जा सकता है, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम से कम, और एक छवि एक बहुत ही उच्च संकेत / पृष्ठभूमि चूहे के साथ किया जाता है। यह आआईओ 11 बनाई है।कई विशेषताओं पुटिकाओं गतिशीलता की निगरानी के लिए पसंद की TIRFM तकनीक बनाते हैं। आदर्श विपरीत और उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात एकल पुटिकाओं से पाने के लिए बहुत कम संकेतों का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। प्रत्येक फ्रेम में चिप आधारित छवि अधिग्रहण अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक अस्थायी समाधान प्रदान करता है। अंत में, नमूने में किसी भी अन्य विमान में रोशनी करने के लिए कोशिकाओं की न्यूनतम जोखिम जोरदार phototoxicity कम कर देता है और लंबे समय तक चलने समय चूक रिकॉर्डिंग 12 में सक्षम बनाता है।
डेटा विश्लेषण इस तकनीक का सबसे चुनौतीपूर्ण और महत्वपूर्ण पहलू बनी हुई है। पुटिका संलयन की निगरानी के लिए सबसे आसान तरीका यह समय 13 से अधिक, कोशिका की सतह पर संवाददाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संचय को मापने के लिए है। के रूप में अच्छी तरह से संलयन बढ़ जाती है, शुद्ध प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ जाती है। हालांकि, इस पद्धति विशेष रूप से बड़े कोशिकाओं में और विश्राम की स्थिति में, इस प्रक्रिया को नजरअंदाज कर सकते हैं,endocytosis और photobleaching प्रक्रियाओं के कारण पुटिका एक्सोसाइटोसिस के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि ऑफसेट है। एक वैकल्पिक तरीका प्रत्येक एकल संलयन घटना 14 का पालन करने के लिए है। यह बाद विधि बहुत संवेदनशील है और फ्यूजन तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं। पूरी तरह से स्वचालित प्रक्रियाओं पुटिकाओं पालन करने के लिए और उनके फ्लोरोसेंट संकेतों के उतार-चढ़ाव रजिस्टर करने के लिए हमेशा उपलब्ध नहीं हैं क्योंकि हालांकि, यह एकल घटनाओं का मार्गदर्शन चयन की आवश्यकता है। पुटिका गतिशीलता का अवलोकन उच्च आवृत्ति पर नमूना कोशिकाओं की आवश्यकता है। यह शायद ही मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जा सकता है कि डेटा की एक बड़ी राशि उत्पन्न करता है।
इस पेपर का प्रस्ताव दोनों, प्रयोगशाला में विकसित की एक प्रक्रिया के डेटा का विश्लेषण करने के लिए एसएच 5YSY neuroblastoma सेल लाइन में बेसल और उत्तेजित neurotransmitter रिहाई की निगरानी के लिए TIRFM इमेजिंग तकनीक का अनुकूलन करने के लिए, और वर्णन करने के लिए, कदम-दर-कदम है पूरे सेल और एकल पुटिका स्तरों पर।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में छवि के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और फ्लोरोसेंट सीडीएनए इनकोडिंग वैक्टर और TIRFM का उपयोग कर, स्रावित कोशिकाओं में पुटिकाओं गतिशीलता का विश्लेषण। TIRFM द्वारा सफल इमेजिंग के मुख्य तत्वों…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Eliana डि Cairano (पोस्ट-डॉक्टरल फेलोशिप) और स्टेफेनिया Moretti (पीएच.डी. फैलोशिप) के लिए समर्थन के लिए विश्वविद्यालय Degli Studi di मिलानो स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम सी.पी. के लिए विश्वविद्यालय के अनुसंधान कार्यक्रम पुर द्वारा समर्थित किया गया
PHluorin निर्माण और डॉ Dotti फ्रांसेस्को डेटा विश्लेषण में सहायता के लिए, और तकनीकी सहायता के लिए सिल्विया Marsicano के लिए हम, प्रो जेरेमी एम हेनले, जैव रसायन के स्कूल, ब्रिस्टल, यूनाइटेड किंगडम विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Equipment | ||||
| Axio Observer Z1 | Zeiss | 491912-9850-000 | inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction |
|
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser |
|
| Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html | |
| 100x Objective | Zeiss | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1 |
|
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf | ||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company | http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html | ||
| Software | ||||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP |
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| Excel | Microsoft | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/ |
||
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
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