שידור סינפטי כימי בין תאי העצב הוא מנגנון עיקרי של תקשורת במערכת העצבים. היא מסתמכת על שחרורו של נוירוטרנסמיטורים דרך מחזור דינמי של איחוי שלפוחית ​​ואחזור באתר presynaptic. רבים מהחלבונים מעורבים בדינמיקת שלפוחית ​​זוהו; עם זאת, התרומה הספציפית שלהם לתופעה עדיין לא הבהירה ^1.

ההבנה שלנו מוגבלת וחלקו על ידי העובדה שהמבחנים הנפוצה ביותר לexo / אנדוציטוזה לא תמיד המתאימים ביותר. מספר מחקרים הקשורים לאיחוי שלפוחית ​​ודינמיקה מסתמכים על טכניקות אלקטרו. טכניקה זו מספקת פתרון זמני אופטימלי והוא מצוין לחקירת ההיתוך הראשוני של שלפוחית ​​לקרום הפלזמה אבל אינה מסוגל לזהות רב של האירועים המולקולריים שבבסיס שתומכים בפונקצית presynaptic. במיקרוסקופ אלקטרונים, בצד השני, מספק morphologica הטוב ביותרl תיאור של כל צעד יחיד, אבל בהיבט הדינמי של האירוע לא יכול לנפול בפח, כי דגימות חייבות להיות קבועה כדי להיות מנותחת.

הכניסה של טכניקות חדשות הקלטה האופטית ^2,3, בשילוב עם התקדמות בפיתוח בדיקות מולקולריות ניאון ^4-6, מאפשרת הדמיה של תהליכי exocytic בתאים חיים, ובכך לספק רמות חדשות של מידע על המבנה והתפקוד הסינפטי.

מחקרים ראשוניים צבעים ניצלו פעילות תלויה styryl (FM1-43 וצבעים אורגניים קשורים) ^7,8. מדינה-של-the-art טכניקות הדמיה להעסיק גרסאות pH רגיש של החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) (pHluorin) קשורים לחלבוני שלפוחית ​​luminal ^9. בדיקות אלה הן בדרך כלל כבויים כאשר קיימים בשלפוחית ​​בגלל pH luminal הנמוך. לאחר התמזגות עם קרום הפלזמה, הפנים השלפוחית ​​חשופים למרחב תאי הניטרלי, pH בפתאומיות מגביר, מקל על מרווה הפרוטון-תלוי של pHluorin ואות הניאון במהירות מופיעה. כשינוי בpHluorin הוא מהיר יותר מאשר אירוע ההיתוך, על ידי ניטור הקרינה עולה, איחוי שלפוחית ​​עם הקרום ניתן למדוד ולנתח. בגלל מולקולות מתויג pHluorin פני שטח endocytosed, אות הקרינה לאחר מכן חוזרת לרמה בסיסית, ולכן אותו המבנה עשוי לשמש גם כדי לפקח על שלפוחית ​​מחזור ^9.

בעוד pH-החיישן מתויג השלפוחית ​​מבטיח ההדמיה רק ​​של אלה שבאמת שלפוחית ​​מתאחה עם קרום הפלזמה, נדרשת הדמיה ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה לתאר בפרטים את השלבים כרוכים בתהליכי endocytic exo /. הטכניקה האופטית המספקת רזולוציה מרחב ובזמן הדרושה היא מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות הפנימית הקרינה (TIRFM), יישום של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^10.

"> השתקפות פנימית מוחלטת מתרחשת בממשק שבין הכיסוי להחליק זכוכית והמדגם. כאשר נתיב האור מגיע לכיסוי להחליק זכוכית עם זווית אירוע גדולה יותר מהזווית הביקורתית, אור העירור אינו מועבר למדגם אך הוא משתקף לחלוטין בחזרה. בתנאים אלה, צורות גל אור חלוף בממשק ומתפשט במדיום עם פחות צפיפות אופטית (לדוגמא). כעוצמת שדה החלוף דועכת אקספוננציאלית עם מרחק מהממשק (עם עומק חדירה של כ -100 ננומטר) רק fluorophores בקרבה הקרובה ביותר לכיסוי החלקה יכולים להיות נרגשים ואילו אלה רחוקים יותר מהגבול אינם. בתאים transfected עם GFP-בונה, עומק זה מתאים לחלבונים הביעו בקרום הפלזמה או במבנים שלפוחי שמתקרב לזה. כפי שלא יכול להיות נרגשת fluorophores בפנים התא, הקרינה הרקע היא ממוזערת, ותמונה עם אות / עכברוש רקע גבוה מאודio נוצר ^11.

כמה מאפיינים להפוך TIRFM הטכניקה של בחירה לניטור דינמיקת שלפוחית. לעומת זאת המושלם ויחס אות לרעש הגבוה מאפשרים זיהוי של אותות נמוכים מאוד הנובעים משלפוחית ​​אחת. רכישת תמונה מבוססת שבב בכל מסגרת מספקת רזולוציה של הזמן הנחוץ כדי לזהות תהליכים דינמיים מאוד. לבסוף, החשיפה המינימלית של תאים לאור בכל מטוס אחר במדגם מאוד מפחיתה phototoxicity ומאפשרת הקלטת הזמן לשגות לאורך זמן ^12.

ניתוח הנתונים נשאר ההיבט המאתגר והחשוב ביותר של טכניקה זו. הדרך הפשוטה ביותר כדי לפקח על איחוי שלפוחית ​​היא למדוד את ההצטברות של חלבוני ניאון כתב על פני התא, לאורך זמן ^13. כתוצאת מגדילה היתוך, עליות אות הקרינה נטו גם כן. עם זאת, שיטה זו עשויה להקל הראש בתהליך, במיוחד בתאים גדולים ובתנאי מנוחה,בגלל תהליכי אנדוציטוזה וphotobleaching לקזז את העלייה בעוצמת הקרינה בשל exocytosis שלפוחית. שיטה חלופית היא לעקוב כל אירוע היתוך אחד ^14. שיטה זו אחרונה היא מאוד רגישה ויכולה לחשוף פרטים חשובים על מנגנוני ההיתוך. עם זאת, זה דורש בחירה הידנית של אירועים בודדים, משום שנהלים באופן אוטומטי לגמרי לעקוב שלפוחית ​​ולרשום את התנודות של אותות הניאון שלהם לא תמיד זמינים. תצפית של דינמיקת שלפוחית ​​דורשת תאי דגימה בתדירות גבוהה. זה מייצר כמות גדולה של נתונים שבקושי ניתן לנתח באופן ידני.

הצעתו של מאמר זה היא לייעל את טכניקת ההדמיה TIRFM לניטור הבסיסית ושחרור הנוירוטרנסמיטר מגורה בשורת תאי נוירובלסטומה SH-5YSY, ולתאר, צעד-אחרת-צעד, שיטה שפותחה במעבדה לניתוח נתונים, שניהם ברמות כל תא וחד-השלפוחית.