TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים
Summary
This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
Abstract
שלפוחית סינפטית לשחרר נוירוטרנסמיטרים בסינפסות כימיות דרך מחזור דינמי של היתוך ואחזור. ניטור פעילות הסינפטית בזמן אמת ולנתח את השלבים השונים של Exo-אנדוציטוזה ברמה חד-השלפוחית הם קריטיים להבנת פונקציות הסינפטי בבריאות ובחוליים.
גנטי מקודד בדיקות pH רגיש ישירות ממוקדות לשלפוחית סינפטית וסכתי פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) מספקים רזולוציה המרחב ובזמן דרושה כדי לעקוב אחרי דינמיקת שלפוחית. שדה החלוף שנוצר על ידי השתקפות פנימית מוחלטת יכול רק לעורר fluorophores ממוקם בשכבה דקה (<150 ננומטר) מעל מכסה הזכוכית שבו תאים לדבוק, בדיוק איפה התהליכים של Exo-אנדוציטוזה יתקיימו. תמונות בחדות גבוהה וכתוצאה מכך מתאימות בצורה אידיאלית לשלפוחית מעקב וניתוח כמותי של אירועי היתוך.
בפרוטוקול זה, n אדם SH-SY5Yתאי euroblastoma מוצעים כמודל בעל ערך ללימוד שחרור הנוירוטרנסמיטר ברמה חד-השלפוחית על ידי TIRFM, בגלל המשטח השטוח שלהם ואת הנוכחות של שלפוחית התפזרה. השיטות לגידול SH-SY5Y כתאים חסיד ולtransfecting עם synapto-pHluorin מסופקות, כמו גם את הטכניקה לבצע TIRFM והדמיה. לבסוף, אסטרטגיה שמטרתה לבחור, לספור, ולנתח אירועי היתוך ברמות כל תא וחד-השלפוחית מוצגת.
כדי לאמת את גישת ניתוח הליך ההדמיה ונתונים, הדינמיקה של שלפוחית מתויגת pHluorin מנותחים תחת מנוחה ומגורה (depolarizing ריכוזי אשלגן) תנאים. שלילת קוטביות הממברנה מגבירה את התדירות של אירועי היתוך וגורמת להעלאה מקבילה של אות הקרינה הנקי שנרשמה בכל תא. ניתוח חד-שלפוחית מגלה שינויים של היתוך-אירוע התנהגות (גובה שיא מוגבר ורוחב). נתונים אלה מצביעים על הבשלילת קוטביות אשלגן לא רק גורם לשחרור הנוירוטרנסמיטר מאסיבי, אלא גם משנה את המנגנון של איחוי שלפוחית ומחזור.
עם הבדיקה הניאון המתאימה, טכניקה זו יכולה להיות מועסק במערכות סלולריות שונות לנתח את מנגנוני הפרשה מכוננת ומגורה.
Introduction
שידור סינפטי כימי בין תאי העצב הוא מנגנון עיקרי של תקשורת במערכת העצבים. היא מסתמכת על שחרורו של נוירוטרנסמיטורים דרך מחזור דינמי של איחוי שלפוחית ואחזור באתר presynaptic. רבים מהחלבונים מעורבים בדינמיקת שלפוחית זוהו; עם זאת, התרומה הספציפית שלהם לתופעה עדיין לא הבהירה 1.
ההבנה שלנו מוגבלת וחלקו על ידי העובדה שהמבחנים הנפוצה ביותר לexo / אנדוציטוזה לא תמיד המתאימים ביותר. מספר מחקרים הקשורים לאיחוי שלפוחית ודינמיקה מסתמכים על טכניקות אלקטרו. טכניקה זו מספקת פתרון זמני אופטימלי והוא מצוין לחקירת ההיתוך הראשוני של שלפוחית לקרום הפלזמה אבל אינה מסוגל לזהות רב של האירועים המולקולריים שבבסיס שתומכים בפונקצית presynaptic. במיקרוסקופ אלקטרונים, בצד השני, מספק morphologica הטוב ביותרl תיאור של כל צעד יחיד, אבל בהיבט הדינמי של האירוע לא יכול לנפול בפח, כי דגימות חייבות להיות קבועה כדי להיות מנותחת.
הכניסה של טכניקות חדשות הקלטה האופטית 2,3, בשילוב עם התקדמות בפיתוח בדיקות מולקולריות ניאון 4-6, מאפשרת הדמיה של תהליכי exocytic בתאים חיים, ובכך לספק רמות חדשות של מידע על המבנה והתפקוד הסינפטי.
מחקרים ראשוניים צבעים ניצלו פעילות תלויה styryl (FM1-43 וצבעים אורגניים קשורים) 7,8. מדינה-של-the-art טכניקות הדמיה להעסיק גרסאות pH רגיש של החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) (pHluorin) קשורים לחלבוני שלפוחית luminal 9. בדיקות אלה הן בדרך כלל כבויים כאשר קיימים בשלפוחית בגלל pH luminal הנמוך. לאחר התמזגות עם קרום הפלזמה, הפנים השלפוחית חשופים למרחב תאי הניטרלי, pH בפתאומיות מגביר, מקל על מרווה הפרוטון-תלוי של pHluorin ואות הניאון במהירות מופיעה. כשינוי בpHluorin הוא מהיר יותר מאשר אירוע ההיתוך, על ידי ניטור הקרינה עולה, איחוי שלפוחית עם הקרום ניתן למדוד ולנתח. בגלל מולקולות מתויג pHluorin פני שטח endocytosed, אות הקרינה לאחר מכן חוזרת לרמה בסיסית, ולכן אותו המבנה עשוי לשמש גם כדי לפקח על שלפוחית מחזור 9.
בעוד pH-החיישן מתויג השלפוחית מבטיח ההדמיה רק של אלה שבאמת שלפוחית מתאחה עם קרום הפלזמה, נדרשת הדמיה ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה לתאר בפרטים את השלבים כרוכים בתהליכי endocytic exo /. הטכניקה האופטית המספקת רזולוציה מרחב ובזמן הדרושה היא מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות הפנימית הקרינה (TIRFM), יישום של מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10.
"> השתקפות פנימית מוחלטת מתרחשת בממשק שבין הכיסוי להחליק זכוכית והמדגם. כאשר נתיב האור מגיע לכיסוי להחליק זכוכית עם זווית אירוע גדולה יותר מהזווית הביקורתית, אור העירור אינו מועבר למדגם אך הוא משתקף לחלוטין בחזרה. בתנאים אלה, צורות גל אור חלוף בממשק ומתפשט במדיום עם פחות צפיפות אופטית (לדוגמא). כעוצמת שדה החלוף דועכת אקספוננציאלית עם מרחק מהממשק (עם עומק חדירה של כ -100 ננומטר) רק fluorophores בקרבה הקרובה ביותר לכיסוי החלקה יכולים להיות נרגשים ואילו אלה רחוקים יותר מהגבול אינם. בתאים transfected עם GFP-בונה, עומק זה מתאים לחלבונים הביעו בקרום הפלזמה או במבנים שלפוחי שמתקרב לזה. כפי שלא יכול להיות נרגשת fluorophores בפנים התא, הקרינה הרקע היא ממוזערת, ותמונה עם אות / עכברוש רקע גבוה מאודio נוצר 11.כמה מאפיינים להפוך TIRFM הטכניקה של בחירה לניטור דינמיקת שלפוחית. לעומת זאת המושלם ויחס אות לרעש הגבוה מאפשרים זיהוי של אותות נמוכים מאוד הנובעים משלפוחית אחת. רכישת תמונה מבוססת שבב בכל מסגרת מספקת רזולוציה של הזמן הנחוץ כדי לזהות תהליכים דינמיים מאוד. לבסוף, החשיפה המינימלית של תאים לאור בכל מטוס אחר במדגם מאוד מפחיתה phototoxicity ומאפשרת הקלטת הזמן לשגות לאורך זמן 12.
ניתוח הנתונים נשאר ההיבט המאתגר והחשוב ביותר של טכניקה זו. הדרך הפשוטה ביותר כדי לפקח על איחוי שלפוחית היא למדוד את ההצטברות של חלבוני ניאון כתב על פני התא, לאורך זמן 13. כתוצאת מגדילה היתוך, עליות אות הקרינה נטו גם כן. עם זאת, שיטה זו עשויה להקל הראש בתהליך, במיוחד בתאים גדולים ובתנאי מנוחה,בגלל תהליכי אנדוציטוזה וphotobleaching לקזז את העלייה בעוצמת הקרינה בשל exocytosis שלפוחית. שיטה חלופית היא לעקוב כל אירוע היתוך אחד 14. שיטה זו אחרונה היא מאוד רגישה ויכולה לחשוף פרטים חשובים על מנגנוני ההיתוך. עם זאת, זה דורש בחירה הידנית של אירועים בודדים, משום שנהלים באופן אוטומטי לגמרי לעקוב שלפוחית ולרשום את התנודות של אותות הניאון שלהם לא תמיד זמינים. תצפית של דינמיקת שלפוחית דורשת תאי דגימה בתדירות גבוהה. זה מייצר כמות גדולה של נתונים שבקושי ניתן לנתח באופן ידני.
הצעתו של מאמר זה היא לייעל את טכניקת ההדמיה TIRFM לניטור הבסיסית ושחרור הנוירוטרנסמיטר מגורה בשורת תאי נוירובלסטומה SH-5YSY, ולתאר, צעד-אחרת-צעד, שיטה שפותחה במעבדה לניתוח נתונים, שניהם ברמות כל תא וחד-השלפוחית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול לתמונה ולנתח את דינמיקת שלפוחית בתאי מפרישים, באמצעות וקטורים בקידוד cDNA ניאון וTIRFM. מרכיבים עיקריים של הדמיה מוצלחת על ידי TIRFM הם הבחירה של המודל הסלולרי וtransfection תא עם אינדיקטורים אופטיים גנטי מקודדים של שחרור שלפוחית ומחזור.
<p class="jov…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות Università degli Studi di Milano לתמיכה לאליאנה Di Cairano (מלגת פוסט-דוקטורט) וסטפניה Moretti (מלגת דוקטורט). עבודה זו נתמכה על ידי המחקר באוניברסיטת תכנית PUR לCP
ברצוננו להודות לפרופ 'ג'רמי מ' הנלי, בית הספר לביוכימיה באוניברסיטת בריסטול, בריטניה, לpHluorin לבנות וד"ר דוטי פרנצ'סקו לסיוע בניתוח נתונים, וסילביה Marsicano לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Equipment | ||||
| Axio Observer Z1 | Zeiss | 491912-9850-000 | inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction |
|
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser |
|
| Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html | |
| 100x Objective | Zeiss | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1 |
|
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf | ||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company | http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html | ||
| Software | ||||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP |
||
| Excel | Microsoft | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/ |
||
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referências
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
- Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
- Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
- Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
- D’Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
- Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
- Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
- Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
